Voraussetzungen
Dieser Versuch ist vom erforderlichen Material und von der Auswertung her relativ einfach. Sie benötigen eine Probenahmevorrichtung und einen Inkubationschrank mit 37±1°C.
Zeitbedarf: hängt von der Anzahl und der Entfernung Ihrer Probenahmestellen ab. Für die Inkubation der Proben sind 18 Stunden vorgeschrieben, bzw. eine Nachkontrolle nach 48 h. Die Auswertung erfordert pro Probenstelle etwa 5-10 min.
Folgeexperimente: Sie können Clostridium perfingens nachweisen, wenn Sie die "anaerobe Kulturtechnik" beherrschen.
Aufgaben
- Sammeln Sie Wasserproben in sterilen 1-Literflaschen aus Badeseen, Fließgewässern oder Brunnen.
- Untersuchen Sie diese Proben quantitativ auf den Gehalt an E.coli und Coliforme Bakterien.
Lernziele
Sie lernen die "offizielle" Methode zum Nachweis fäkaler Keime im Badewasser kennen. Damit verstehen Sie leichter, auf welcher Grundlage Gesundheitsbehörden manchmal die Sperrung von Badegewässern veranlassen. Das Prinzip der Untersuchung kann leicht auf Trinkwasser- und Lebensmitteluntersuchungen ausgedehnt werden.
Zusatzinformationen
Darmflora | Idexx-Verfahren
Darmflora
E. coli wird als Leitkeim für fäkale Verunreinigungen genutzt, obwohl dieser Keim zahlenmäßig nicht der häufigste Keim im menschlichen Darm ist. Er ist jedoch relativ schnell, einfach und spezifisch nachweisbar.
| Tabelle 1: Zusammensetzung der Bakterienpopulation im menschlichen Darm (nach W.E.C. Moore, L.V. Holdeman, Appl. Microbiol. 27 (1974), 961-979) | ||
| Species | Keimzahl (10n pro g Trockenmasse) | % |
| Bacteroides vulgatus | 5,8 | 12,1 |
| Fusobacterium prausnitzii | 3,4 | 7,1 |
| Bifidobacterium adolescentis | 3,1 | 6,5 |
| Eubacterium aerofaciens | 2,9 | 6 |
| Peptostreptococcus productus | 2,7 | 5,6 |
| Bacteroides thetaiotaomicron | 2,1 | 4,5 |
| Eubacterium eligens | 1,7 | 3,7 |
| Peptostreptococcus productus | 1,6 | 3,3 |
| Eubacterium biforme | 1,5 | 3,2 |
| Eubacterium aerofaciens III | 1,2 | 2,5 |
| Eubacterium rectale | 1,1 | 2,4 |
| Bacteroides disatsonis | 1,1 | 2,4 |
| Eubacterium rectale II | 1,1 | 2,3 |
| Bifidobacterium longum | 0,9 | 1,8 |
| Bifidobacterium infantis | 0,7 | 1,5 |
| Lactobacillus acidophilus | 0,6 | 1,3 |
| Bacteroides fragilis | 0,3 | 0,6 |
| Bifidobacterium bifidum | 0,2 | 0,4 |
| Escherichia coli | 0,2 | 0,4 |
| Streptococcus salivarius | 0,2 | 0,4 |
Bacteroides-, Eubacterium-, Bifidobacterium-und Fusobacterium-Arten sind nach dieser Informationsquelle die häufigsten Darmbakterien beim Menschen. Es ist zu beachten, dass Tiere in ihrem Darm eine von dieser Auflistung abweichende Populationszusammensetzung haben. Auch Clostridium perfingens kommt mit Ausnahme des Pferdes und des Kaninchens in beträchtlicher Anzahl im Darm der Menschen und anderer Haustiere vor.
Zum Nachweis länger zurückliegender fäkaler Verunreinigungen in Gewässerproben ist Clostridium perfingens besser geeignet, als E. coli. Clostridium perfingens ist ein anaerober Keim, der außerhalb des Darms Endosporen bildet, die ihm ein längeres Überleben unter für ihn ungünstigen Wachstumsbedingungen erlauben. Solche Endosporen könnten eventuell sogar die Trinkwasserdesinfizierung überleben.
Das Idexx-Verfahren
Mit dem Idexx-Verfahren werden 100 ml Wasserprobe untersucht. Dazu wird dem Probewasser ein Mediumpulver zugemischt, geschüttelt und für mehrere Stunden im Brutschrank bei 37°C inkubiert. Anschließend wird die Anzahl an gelbgefärbten bzw. unter UV-Licht fluoreszierenden Reaktionskammern ausgewertet.
Da dieses Nachweisverfahren auf Fluoreszenz beruht, ist es besonders nachweisstark. Daher können die Inkubationszeit der Proben kurzgehalten werden, was bei kritischen Trinkwasseruntersuchungen ein wichtiger Vorteil ist. Der Untersucher kann sehr schnell ein Gefährdungspotenzial abschätzen.
Abbildung 1: Analyse von zwei Wasserproben mit dem Idexx-Verfahren. Links: wenige Coliforme (d.h. dunkel gefärbte Kompartimente) und nur ein E. coli-haltiges Kompartiment. Rechts: Viele dunkelgelb gefärbte Kompartimente = viele Coliforme Keime. Drei dieser Kompartimente fluoreszieren unter UV-Licht der Wellenlänge 366 nm = enthalten E. coli.
Die Auswertung solcher Ansätze erfolgt beim Idexx-Verfahren nach einer ähnlichen McCrady Tabelle, wie mit der MPN-Methode in diesem Versuch.
Glossar
Probleme
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Die Luftblase geht vor dem Autoklavieren nicht aus dem Durham-Röhrchen | Verschließen Sie das Röhrchen mit Parafilm. Kippen Sie das Röhrchen dann einmal vorsichtig über seine Längsachse. |
| In keinem der Röhrchen ist Wachstum zu beobachten, obwohl viele Coliforme Bakterien in der Probe zu erwarten sind. | Prüfen Sie, ob der pH-Wert der Probe und des Mediums im neutralen Bereich liegen. Prüfen Sie, ob bakterizide Substanzen in der Probe vorhanden sein könnten. |
Sicherheit
Solange Sie mit einem geschlossenen System arbeiten und am Ende des Experimentes Ihre Ansätze durch Autoklavieren inaktivieren, ist keine Gefährdung erkennbar.
| Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien | |
| Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze | 100 KB |
Tipps und Hinweise
- Für eine korrekte Probenahme in einem Gewässer ist es wichtig, die Probe 10-20 cm unterhalb der Gewässeroberfläche in der Mitte eines Flusses zu entnehmen. Daher sollten Sie eine Probenahmestange besitzen, in der die Probenahmeflaschen sicher festgehalten werden. Beachten Sie, die Flaschen erfahren einen Auftrieb, wenn Sie sie unter Wasser drücken.
- Verwenden Sie grundsätzlich nur sterilisierte Flaschen mit passenden sterilen Gummistopfen und Schraubverschlüssen.
- Werden die Proben länger als 4 Stunden bis zum Animpfen der Medien gelagert, dann müssen Sie dunkel aufbewahrt und auf Eis transportiert werden.
- Öffentliche Brunnen können eine ergiebige Quelle für solche Untersuchungen sein.
- Sie können aus einer Probenahme weitere Parameter der Gewässermikrobiologie bestimmen, z.B. Koloniebildende Einheiten, Coliforme, etc.
- Wenn Sie das Durham-Röhrchen ins Medium geben, um die Gasbildung zu bestimmen, dann muß vor dem Autoklavieren die meiste Luft aus diesem Röhrchen entfernt sein. Sie erreichen diesen Zustand, in dem Sie das große, mit Medium gefüllte Kulturröhrchen, mit Parafilm verschließen und einmal vorsichtig über seine Längsachse kippen. Dabei läuft das Durhamröhrchen voll Medium. Kleine Glasblasen im Durhamröhrchen sollten beim Autoklavieren entfernt werden.
Unterlagen
Die Zahlen geben die Dateigrößen in KB wieder. Zum Lesen der pdf-Dateien benötigen Sie den Adobe Acrobat Reader (einige Dateien wurden für Version 7 oder besser optimiert!). Zum Betrachten der ppt-Dateien benötigen Sie Microsofts PowerPoint. Deren Ausdruck als pdf-Datei erlaubt Ihnen die Herstellung von Folien für den Tageslichtprojektor.
Tipp: Laminieren Sie solche Seiten, die Sie häufiger als Arbeitsunterlagen nutzen möchten.
| E. coli-Nachweis | 1400 KB | |
| Selektiver E. coli-Nachweis | 138 KB | |
| Namensgeber Herr Escherich | 310 KB | |
| Fluorocult-Laurylsulfat Medium | 230 KB | |
| Fluorgene Nachweise | 30 KB | |
| Readycult System | 390 KB | |
| Protokoll für Probennahme | 25 KB | |
| Ergebnis-Protokoll | 30 KB | |
| McCrady Auswertetabelle | 580 KB | |
| Qualität von Badegewässern | 95 KB |
Fragen
- Warum sollte die Probenahme unter der Wasseroberfläche stattfinden?
- Welche Gefahren könnten von fäkal verunreinigten Gewässern für Menschen ausgehen?
- Welche anderen Testverfahren wären für den Nachweis von fäkalen Verunreinigungen in Gewässern denkbar?
- Was verstehen Sie unter "Gesamtcoliforme"?
- Was verstehen Sie unter "KBE", was unter Gesamtkeimzahl?
- Welches Gas könnte aus dem Disaccharid Lactose gebildet werden?
- Warum werden Wasserkeime bei 28°C inkubiert, Coliforme und E. coli aus Wasserproben jedoch bei 37°C?