Methode

Eine Übersicht zu den Schritten des Experimentes.

1. Zentrifugieren Sie 5-30 ml bakterienhaltige Wasserproben ab: 5 min bei 13000 x g
2. Resuspendieren Sie den Niederschlag in 100 µl Wasser in einem Eppendorfgefäß.
3. Inkubieren Sie diese Suspension für 10 min bei 98°C.
4. Kühlen Sie die Probe 5 min auf Eis ab.
5. Zentrifugieren Sie den Zellaufschluss ab: 5 min bei 13000 x g.
6. Geben Sie den DNA-haltigen Überstand in ein frisches steriles Eppendorfgefäß: Template-DNA für die PCR.
7. Verwenden Sie aus diesem Überstand 5 µl für die PCR.
8. Beschicken Sie die Ready-to-go-beads mit
   1. 5 µl Template-DNA
   2. 1 µl Primer int.F (10 pmol)
   3. 1 µl Primer int.R (10 pmol)
   4. 18 µl steriles Wasser
9. Mischen Sie diese Ansätze gut.
10. Starten Sie das PCR-Programm.
11. Analysieren Sie das PCR-Produkt durch die Agarosegelelektrophorese in einem 2,5%-igen Gel bei 10 V/cm Elektrodenabstand.

Alternativ können Sie 5-7 µl des PCR-Produktes für die Agarosegelelektrophorese bereitstellen und den Rest für einen Verdau mit Restriktionsendonukleasen einsetzen.

Reinigen Sie den Rest des PCR-Ansatzes mit einem Nucleospin Extract Kit.

1. Mischen Sie ein Volumen PCR-Ansatz (20 µl) mit vier Volumen NT2 Puffer (80 µl).
2. Geben Sie ein Nucleospin Extract Säulchen in ein 2 ml Tube.
3. Geben Sie die Mischung aus Schritt 1 auf die Säule.
4. Zentrifugieren Sie 1 min bei 11000 x g.
5. Verwerfen Sie den Durchlauf.
6. Geben Sie 600 µl NT3 auf die Säule.
7. Zentrifugieren Sie 1 min bei 11000 x g.
8. Verwerfen Sie den Durchlauf.
9. Geben Sie 200 µl NT3 auf die Säule.
10. Zentrifugieren Sie erneut für 1 min bei 11000 x g.
11. Entfernen Sie den Puffer vollständig aus der Säule und geben Sie diese Säule in ein frsiches, steriles 1,5 ml Eppendorfgefäß.
12. Geben Sie 30 µl NE-Elutionspuffer auf die Säule.
13. Inkubieren Sie 1 min bei Raumtemperatur.
14. Eluieren Sie das PCR-Produkt durch Zentrifugation (1 min, 11000 x g) von der Säule.

Diese gereinigten PCR-Produkte können jetzt für einen Verdau mit Resitiktionsendonukleasen eingesetzt werden. Geben Sie dazu in ein frisches, steriles 1,5 ml Eppendorfgefäß folgende Lösungen:

1. 15 µl gereinigtes PCR-Amplifikat
2. 2 µl steriles Wasser
3. 2 µl RE-Puffer (passend zur verwendeten Restriktionsendonuklease)
4. 1µl Restriktionsendonuklease (z.B. PvuII oder BglI)
5. Inkubieren Sie den Ansatz für 37°C für 1 Stunde

Agarosegelelektrophorese:

1. Mischen Sie jeweils 5 µl des unverdauten oder des verdauten PCR-Produktes mit 2 µl Ladepuffer.
2. Tragen Sie die gemischten Proben auf ein 2,5%-iges Agarosegel in TAE-Puffer.
3. Entwickeln Sie das Agraosegel bei 10 V pro cm Elektrodenabstand (also 120 V bei 12 cm) für etwa 1 Stunde.
4. Färben Sie das Agarosegel in Ethidiumbromid (1 µg/ml TAE-Puffer).
5. Dokumentieren Sie das Ergebnis mit Hilfe einer digitalen Kamera, dem GelStar Photographic Filter und einem UV-Transilluminator.