Zusatzinformationen

Allgemeines | Elektroporation | Transduktion | Konjugation | Transfektion | Satellitenbildung

Allgemeines

Viele Zellen nehmen DNA als lange Fragmente normalerweise nicht auf. Die Ladungen auf der Zellmembran und die negative Ladung (Phosphatgruppen) auf der DNA verhindern eine solche Aufnahme. Daher wurden verschiedene Techniken entwickelt, die einen effizienten DNA-Transfer in andere Zellen ermöglichen. Diese Techniken wurden teilweise aus natürlichen Vorgängen entlehnt.

Da bei einem solchen Experiment nicht jede Zelle einen Vector aufnehmen wird, muß ein Selektionskriterium die Aufnahme des Vectors in die Zielzelle anzeigen. Ein solches Selektionskriterium stellt das Antibiotikumresistenzgen im Vector dar. Nur solche Zellen, die den Vector aufgenommen haben, können auch auf dem antibiotikumhaltigen Medium wachsen. Die Zellen, die keinen Vector aufnahmen, werden im Wachstum gehemmt werden. In diesem Fall entwickeln sich keine Kolonien.

Elektroporation

Das Verfahren ist in seinem Mechanismus nicht bekannt. Salzfreie, kompetente Zellen werden zusammen mit dem zu transformierenden Vector in einer speziellen Elektroden-Küvette für kurze Zeit (msec-Bereich) einem Hochspannungsfeld (2000 bis 2500 V) ausgesetzt. Man nimmt an, dass während des Spannungspulses "Löcher" in der Zellmembran gebildet werden, durch die der Vector in die Zellen gelangen kann. Dieses Verfahren muss für jeden Zelltyp optimiert werden. Für das Herstellen kompetenter Zellen werden unterschiedliche Strategien verfolgt. So werden z.B. Zellen in der Kälte mit Calciumchlorid gewaschen, oder bei sehr niedrigen Wachstumstemperaturen gezüchtet.

Transduktion

Die Natur hat Phagen entwickelt, die ihre Wirtszellen infizieren können. Das Phagengenom wird dabei in das Genom der Wirtszelle eingebaut. Für die Freisetzung des Phagen wird dessen Genom wieder aus dem Wirtsgenom ausgeschnitten. Bei diesem Vorgang werden Teile des Wirtsgenoms "mitgenommen". Die Menge der mitgenommen Wirts-DNA richtet sich nach dem verfügbaren Platz im Phagenkopf.

Konjugation

Bei diesem natürlichen Vorgang tauschen zwei nahe verwandte Bakterien ihr genetisches Material aus. Dazu wird eine Konjugationsbrücke zwischen den Zellen gebildet. Eine "Donorzelle" überträgt dann DNA durch diesen Kanal in die "Rezipientenzelle". Je nach Dauer des "matings" wird dabei mehr oder weniger viel genomische DNA übertragen.

Transfektion

Hierunter wird die Aufnahme von reiner Viren/Phagen-DNA in pro- und eukaryotische Zellen verstanden. Es sind also keine Phagenpartikel wie in der Transduktion beteiligt.

Satellitenbildung

Bei der Suche nach Klonen werden insbesondere nach längerer Inkubationszeit der Agarplatten so genannte Satelliten um blaue oder auch weiße Kolonien beobachtet. Das sind Klone, die kein Plasmid mit einem Antibiotikaresistenzgen enthalten. Sie konnten auf der Agarfläche überleben, die nur bakteriostatische nicht aber bakterizide Konzentrationen des Antibiotikums enthielten. Solche Konzentrationen können durch die beta-Lactamase-Aktivität der zentralen Kolonie verursacht werden, die das bla-Gen auf dem Plasmid trägt.