Voraussetzungen
- Sie benötigen einen plasmidfreien E. coli Stamm, sowie einen E. coli Vector.
- Der Vector sollte in einer hochwertigen Qualität vorliegen ("supercoiled" Form). Sie haben dafür eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt und das Ergebnis der Plasmidpräparation richtig interpretiert.
- Ausserdem können Sie die Kulturen auf Agarplatten ausstreichen und züchten.
- Wenn Sie keine Genehmigung für ein S1-Gentechniklabor besitzen, dürfen Sie dieses Experiment nur mit E. coli Plasmid-DNA durchführen. Der E. coli-Vector kann aber Fragmente chromosomaler E. coli-DNA enthalten.
Zeitbedarf:
Sie müssen die Zeit für eine Übernachtkultur, ca. 40-60 min für die Transformation und eine weitere Übernachtinkubation einkalkulieren. Für die Auswertung benötigen Sie weitere 10-20 min. Die Kontrolle auf Plasmidgehalte erfordert etwa 1 Stunde.
Folgeexperimente:
Homologe Transformationen und die GFP-Klonierung.
Aufgaben
- Stellen Sie kompetente E. coli Zellen her. Wählen Sie dazu eines der beiden beschriebenen Verfahren.
- Transformieren Sie das Plasmid pUC18 in diese kompetenten Zellen.
- Selektionieren Sie auf die Transformanden.
- Bestimmen Sie die Transformationseffizienz Ihres Versuches.
- Überprüfen Sie einige Transformanden auf ihren Plasmidgehalt.
Lernziele
Sie lernen in diesem Experiment, kompetente E. coli Zellen herzustellen, einen Vector in diese E. coli Zellen einzuschleusen und auf die Transformanden zu selektionieren. Das Experiment zeigt Ihnen das Prinzip, nach dem auch Fremd-DNA in E. coli eingeschleust werden kann. Für ein solches Experiment benötigen Sie dann allerdings ein genehmigtes Gentechniklabor.
Probleme
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Keine Transformanden auf der Agarplatte. | Haben Sie Plasmid zu den kompetenten Zellen gegeben? Waren die Zellen wirklich kompetent? Haben Sie die Mengenangaben für das Plasmid beachtet? Zu große Mengen Plasmid erniedrigen die Transformationseffizienz. |
| Transformanden als Rasen auf der Agaroberfläche. | Haben alle "Transformanden" wirklich ein Plasmid aufgenommen? Könnte kein Antibiotikum oder in zu geringer Konzentration im Medium vorliegen? |
Sicherheit
Aus statistischen Gründen müssen Sie zur Selektion erfolgreich transformierter Zellen mit einer Antibiotikaresistenz arbeiten. Sammeln Sie alle Lösungen und Gefäße, die mit Antibiotika oder der Antibiotikaresistenz in Berührung gekommen sind. Autoklavieren Sie diese Materialien am Ende Ihres Experimentes.
| Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien | |
| Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze | 100 KB |
| Dimethylsulfoxid (DMSO) | 20 KB |
| PEG | 20 KB |
| TransformAid Bacterial Transformation Kit | 120 KB |
Tipps und Hinweise
- Verwenden Sie für die Plasmidpropagierung nach Möglichkeit DH5alpha, XL1-blue oder andere endA-negative E. coli Stämme.
- Bestimmen Sie durch eine Verdünnungsreihe in einer Agarosegelelektrophorese unbedingt die Plasmidmenge, die Sie zur Transformation gedenken einzusetzten. In diesem Versuch gilt nicht das Motto "viel hilft viel".
- Achten Sie auf die Plasmidmengen, die Sie zur Transformation einsetzen. Fermentas empfiehlt 10-100 pg in einem µl Wasser. Schätzen Sie die Plasmidmenge im Ethidiumbromid-gefärbten Agarosegel ab. Eine gerade noch sichtbare Bande enthält etwa 5-10 ng Plasmid.
- Pipettieren Sie alle Lösungen, die Plasmide enthalten sehr sorgfältig. Vermeiden Sie Scherkräfte, die das Plasmid "nicken". Sie sollten grundsätzlich "supercoiled" Plasmid-DNA für die Transformation verwenden. Überzeugen Sie sich durch eine Agarosegelelektrophorese von der Qualität der Plasmid-DNA.
- Halten Sie die Bakterien während der Transformationsprozedur auf Eis, wenn keine andere Temperatur angegeben ist.
Fragen
- Wie erklären Sie den Widerstand der Cytoplasmamembranen gegen die Aufnahme von DNA?
- Welche Methoden gibt es zum Einschleusen von DNA in Zellen?