Restriktionsverdau
Ergebnisse
Das Programm NEBcutter sagt als Fragmentierungsmuster mit BglI für das Plasmid pUC18 zwei Schnitte voraus, die bei der zirkulären DNA zwei Fragmente mit den Längen von 1568 Bp und 1118 Bp ergeben sollten. Die nachfolgende Abbildung zeigt den experimentellen Befund und diese Vorhersage.
Abbildung 1: Links: Verdau des Plasmides pUC18 mit der Restriktionsendonuklease BglI. Rechts: Vorhergesagtes Fragmentierungsmuster dieses Verdaues durch den NEBcutter.
Die Addition der beiden Fragmentlängen ergibt 2686 Bp, was der Größe des Plasmides pUC18 entspricht. Die Größen der Plasmide werden immer für die linearisierte Form angegeben. Diese erhalten Sie im Falle von pUC18, in dem Sie das Plasmid mit Hind III verdauen. Hind III ist eine Restriktionsendonuklease der multiple cloning site (MCS). Die Endonukleasen der MCS schneiden Vektoren sinnvoller Weise nur einmal, nämlich in dieser MCS, was zur Linearisierung des Vektors führt.
Abbildung 2: Verdau verschiedener Formen des Plasmides pUC18. Von der linken zur rechten Spur: Längenstandard mit Angabe der Fragmentlängen in Bp. "pUC18 blau": pUC18 Plasmid wie isoliert. "pUC18 weiß": pUC18 Vektor mit Insert, wie isoliert. "pUC18 blau Hind III" ist pUC18 geschnitten mit Hind III. "pUC18 weiß Hind III" ist pUC18 mit Insert, geschnitten mit Hind III.
Wie in Abbildung 2 zu sehen ist, werden durch den Verdau von "pUC18 weiß" mit HindIII zwei Fragmente gebildet. Eins davon läuft exakt auf der Höhe des linearisierten Vektors, das andere bei etwa 5000 Bp. Aus diesem Befund ist zu schließen, dass das Insert von etwa 5000 Bp in die HindIII Schnittstelle der MCS einkloniert wurde.