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Voraussetzungen

  • Sie haben mindestens eine Restriktionsendonuklease mit den zugehörigen Reagenzien. Sie können dieses Enzyme bei minus 20°C lagern.
  • Sie haben gereinigte DNA, (z.B. die eigene Plasmidpräparation) an der Sie die Enzymaktivität ausprobieren können.
  • Sie haben eine Inkubationsmöglichkeit für Eppendorfgefäße (in der Regel bei 37°C)
  • Sie können die Agarosegelelektrophorese anwenden.
  • Sie müssen unbedingt mit Ihren Pipetten in der Lage sein, die geforderten kleinen Volumina exakt zu pipettieren.

     

Zeitbedarf

Für den RE-Verdau benötigen Sie 45-60 min. Für die Agarosegelelektrophorese weitere 1,5 Stunden.





Folgeexperimente

Mit diesem Versuch erschließen Sie sich eine grundlegende molekularbiologische Arbeitstechnik. Sie ist Voraussetzung für Klonierungsexperimente und bestimmte Formen des Fingerprintings (RFLP).





Aufgaben

  1. Verdauen Sie Plasmid- oder Phagen-DNA mit einem Restriktionsenzym Ihrer Wahl.
  2. Beachten Sie die Bedingungen, die der Enzymlieferant für die Anwendung dieses Enzyms empfiehlt. Verwenden Sie die mitgelieferten Reagenzien.
  3. Trennen Sie die Reaktionsprodukte im der Agarosegelelektrophorese auf, färben Sie das Gel und dokumentieren Sie das Ergebnis.

Lernziele

Am Beispiel-Verdau einer Plasmid-DNA und der DNA aus dem Phagen Lambda lernen Sie mit Restriktionsendonukleasen umzugehen. Sie werden in der Lage sein, beliebige andere DNA zielgerichtet zu hydrolysieren und die Reaktionsprodukte des Verdaues zu analysieren.

Probleme

 

Beobachtung Lösungsansatz
Keine DNA-Fragmentierung. Haben Sie die Bedingungen für das verwendete Restriktionsenzym eingehalten?

Ist die template-DNA sauber? Sind Proteine, Lösungsmittel, Phenol, etc vollständig abgetrennt worden?

Ist die DNA methyliert?

Haben Sie zu große Volumina einer RE verwendet, die in Glycerin geliefert wird?
Mehr DNA-Banden, als nach der Nukleotidsequenz zu erwarten sind. Haben Sie eine mit Fremd-DNA kontaminierte DNA vorgelegt?

Besitzt die verwendete RE "star activity"?
Keine DNA-Banden aber ein Schmier ist im Gel zu sehen. Haben Sie unsteril gearbeitet? Können Nukleasen in den Ansatz gelangt sein?
Die Fragmentlängen addieren sich auf eine Gesamtlänge, die größer als die theoretische Länge des pUC18 sind. Haben Sie pUC18 mit einem Insert verdaut? In diesem Fall könnten Sie zwei Banden erhalten, wenn das Insert in die Eco RI Schnittstelle der MCS (multiple cloning site) kloniert wurde.

Sicherheit

Es sind keine Sicherheitsrisiken beim Restriktionsendonuklease-Verdau bekannt. Für die Analyse der Reaktionsprodukte beachten Sie bitte die Hinweise bei der Agarosegelelektrophorese.

 

Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien
 
Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze 100 KB
Ethidiumbromid 33 KB

Tipps und Hinweise

  • Halten Sie sich genau an die Volumenangaben. Sie müssen unbedingt mit Ihren Pipetten in der Lage sein, die geforderten kleinen Volumina exakt zu pipettieren.
  • Nutzen Sie nur die Reagenzien (Puffer), die der Enzymlieferant der RE beigelegt hat.
  • Wenn Sie unbedingt methylierte Erkennungsstellen schneiden müssen, so suchen Sie in den Datenbanken wie REbase nach iso- oder neoschizomeren Enzymen.
  • Beachten Sie bei der RE-Aktivität die Lage der Schnittstelle. Sind die flankierenden Bereiche kleiner als 10 Nukleotide, so kann die Aktivität mancher RE stark reduziert sein. Außerdem haben diese flankierenden Nukleotidsequenzen einen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Hydrolyse. Nicht jede Schnittstelle wird in gleicher Geschwindigkeit gespalten! Die Unterschiede können beträchtlich (> 10-fache Geschwindigkeit) sein.
  • Für einen RE-Verdau als Vorbereitung auf ein Klonierungsexperiment sollten Sie sticky end-liefernde REs einsetzen.
  • Die RE-Aktivitätseinheit ist anders definiert, als sie sonst für Enzyme üblich ist. Eine RE-Einheit hydrolysiert in einer Stunde 1 µg der angegebenen DNA. Beachten Sie für einen Vergleich der RE-Aktivitäten, dass hier die Anzahl der Schnittstellen einer jeden RE eine wichtige Rolle spielt.
  • Berücksichtigen Sie bei der Auswahl der RE den GC-Gehalt der Ziel-DNA und der Schnittstelle dieser RE. Eine RE wie SmaI (CCC/GGG) wird kaum in einer AT-reichen Region schneiden.
  • 0,1 µg BSA (Rinderserumalbumin) pro µl Ansatz kann den RE-Verdauen beigegeben werden, da dadurch die Aktivität einiger REs gesteigert wird.
  • Sind Sie aus irgend einem Grund gezwungen, einen anderen, als den mitgelieferten RE-Puffer zu verwenden, z.B. weil Sie einen Doppelverdau durchführen möchten, so sollten Sie sich in Datenbanken von der Aktivität Ihrer REs in diesem Puffer überzeugen.
  • Sie inaktivieren Restriktionsenzyme durch Inkubation bei 60°C für 20 min, durch Zugaben von EDTA oder durch Zugabe von Phenol/Chloroform.
  • Halten Sie Ihre REs immer bei minus 20°C. Wenn Sie für einen Verdau RE-Aktivität aus Ihren Vorräten entnehmen, dann sollte das schnell geschehen. Die entnommene RE-Aktivität sollten Sie während des Versuches auf einem Kühlblock lagern.
  • Verdünnen Sie nach Möglichkeit nicht die RE-Aktivitäten. Verdünnungen können zum raschen Verlust der Enzymaktivität führen.

Fragen

  1. Zu welcher Enzymklasse gehören die Restriktionsendonukleasen?
  2. Was ist die "star activity"?
  3. Lassen sich methylierte Erkennungssequenzen dennoch mit einer RE hydrolysieren?
  4. Warum ist es sinnvoll, dass die Restriktionsendonukleasen der MCS (multiple cloning site) nur eine Schnittstelle auf der gesamten Nukleotidsequenz des Vektors besitzen?
  5. Wie könnte die Strategie aussehen, eine in der Nukleotidsequenz des Vektors mehrfach vorkommende Schnittstelle einer RE der MCS in allen Schnittstellen außerhalb der MCS zu entfernen?