Methode

Das Experiment verläuft nach folgenden Schritten:

Sie kultivieren über Nacht 5 ml pUC18-haltige E. coli DH5-alpha Kulturen mit 150 µg Ampicillin pro ml Medium. Dann ernten Sie die Zellen aus 2 ml Kultur durch Zentrifugation in der Tischzentrifuge. Aus diesem Zellniederschlag wird das Plasmid mit dem Qiagen MiniPrep Kit isoliert.

• Wie im Kultivierungsexperiment bereiten Sie 5 ml LB-Medium in 20 ml Reagenzgläsern mit Alu-Kappen vor; dann autoklavieren Sie diese Ansätze.
• Nach dem abkühlen auf Raumtemperatur geben Sie 75 µl Ampicillin-Stammlösung hinzu (entspricht 150 µg Amp/ml Kultur).
• Impfen Sie die Medien mit 50 µl E. coli DH5-alpha Flüssigkultur an, oder inokulieren Sie mit einem Zahnstocher aus Ihrer Stammkultur.
• Züchten Sie diese Kulturen auf dem Schüttler bei 250 Upm und 37°C über Nacht.
• Wenn nicht anders vermerkt, so wird bei voller Leistung der Tischzentrifuge und bei Raumtemperatur zentrifugiert.

Arbeitsanweisung für den Qiagenkit:

1. Zentrifugieren Sie 2 ml der Bakteriensuspension (5000 x g, 2 min, Raumtemperatur) in einem Eppendorfreaktionsgefäß. Verwerfen Sie den Überstand: dieser enthält Mediumbestandteile. Fahren Sie mit dem Niederschlag fort. Dieser besteht aus den Bakterienzellen, die Sie für den nächsten Arbeitsschritt benötigen.
2. Resuspendieren Sie die Zellen in 250 µl Puffer P1, der RNase A enthält: es dürfen keine Zellklumpen mehr zu sehen sein! Sie können bei diesem Schritt ausnahmsweise einen Vortexer zur Hilfe nehmen.
3. Geben Sie 250 µl Puffer P2 dazu und mischen Sie vorsichtig: 5-6 mal das Reaktionsgefäß umdrehen; inkubieren Sie den Ansatz für 5 min.
4. Geben Sie 350 µl Puffer N3 dazu und mischen Sie sofort vorsichtig: 5-6 mal das Reaktionsgefäß umdrehen; Lösung sollte trübe werden.
5. Zentrifugieren Sie für 10 min (volle Leistung, Raumtemperatur). Der Überstand enthält das Plasmid, das für den nächsten Arbeitsschritt benötigt wird.
6. Überstand aus Schritt (5.) wird mit einer 1 ml Pipette auf eine QIAprep-Säule aufgetragen, die in ein 2 ml Zentrifugenröhrchen gesteckt wird.
7. Zentrifugieren Sie für 30-60 sec und verwerfen Sie den Durchlauf; dieser enthält Proteine und Puffersalze.
8. Waschen Sie die QIAprep-Säule mit 0.5 ml Puffer PB. Tragen Sie dazu den Puffer auf die Säule auf und zentrifugieren Sie für 30-60 sec. Der Durchlauf wird verworfen, da er Proteine und Puffersalze enthält.
9. Tragen Sie auf die QIAprep-Säule 0.75 ml Puffer PE auf, zentrifugieren Sie 30-60 sec lang und verwerfen Sie den Durchlauf: dieser enthält Proteine und Puffersalze. Zentrifugieren Sie erneut (ca. 1 min), um den Puffer PE vollständig zu entfernen.
10. Geben Sie das QIAprep-Säulchen in ein frisches, steriles 1,5 ml Eppendorfreaktionsgefäß. Geben Sie auf die Säule 50 µl Puffer EB (10 mM Tris-HCl, pH 8.5) oder Wasser, warte 1 min und zentrifugiere für 1 min.
11. Der Durchlauf enthält die Plasmid-DNA. Diese können Sie enzymatisch mit Restriktionsendonukleasen behandeln und in der Agarosegelelektrophorese analysieren.