Methode für Bakterien (Prokaryoten)

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Isolieren Sie chromosomale DNA aus Prokaryoten nach folgenden Schritten:

1. Zentrifugieren Sie bis zu 2 x 109 Zellen in einem Eppendorfreaktionsgefäß: 5 min bei 5000 x g. 
2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Zellniederschlag in 180 µl ATL-Puffer. 
3. Geben Sie 20 µl Proteinase K hinzu. 
4. Mischen Sie die Probe und inkubieren Sie den Ansatz 30 min bei 55°C. 
5. Geben Sie 4 µl RNase A (100 mg/ml) hinzu. mischen Sie und inkubieren Sie die Proben für 2 min bei Raumtemperatur. 
6. Vortexen Sie den Ansatz für 15 sec. 
7. Geben Sie 200 µl AL-Puffer hinzu und mischen Sie die Lösung. 
8. Inkubieren Sie die Probe 10 min bei 70°C. 
9. Geben Sie 200 µl 96-100%-igen Ethanol hinzu. Mischen Sie die Lösung auf dem Vortexer. 
10. Pipettieren Sie diese Mischung auf eine DNeasy-Säule, die in einem 2 ml Eppendorfgefäß steckt. 
11. Zentrifugieren Sie 1 min bei 6000 x g. Verwerfen Sie den Durchlauf und das Eppendorfgefäß. 
12. Stecken Sie das DNeasy-Säulchen in ein frisches 2 ml Eppendorfgefäß. Geben Sie 500 µl AW2-Puffer hinzu. 
13. Zentrifugieren Sie 3 min bei voller Leistung in der Eppendorfzentrifuge. Verwerfen Sie den Durchlauf und das Eppendorfgefäß. 
14. Geben Sie das DNeasy-Säulchen in ein frisches, steriles Eppendorfgefäß. Geben Sie 200 µl AE-Puffer auf die Membran des Säulchens und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 min. 
15. Zentrifugieren Sie 1 min bei 6000 x g. 
16. Geben Sie erneut 200 µl AE-Puffer auf die Membran. Inkubieren Sie erneut 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie erneut 1 min bei 6000 x g. 
17. Führen Sie eine Agarosegelelektrophorese durch, um Ihre Präparation der chromosomalen DNA zu überprüfen. Benutzen Sie dafür ein 0,8%-iges Agarosegel.