Voraussetzungen
Die materiellen Voraussetzungen sind gering: Sie benötigen einen DNA-Isolierungskit, eine Tischzentrifuge, automatische Pipetten mit sterilen Pipettenspitzen und Inkubationsmöglichkeiten bei 55 und 70°C. Sie können mit diesen Hilfsmitteln umgehen und steril arbeiten.
Zeitbedarf: Sie benötigen etwa 40-60 min Zeit für die Isolierung. Die Prozedur kann nicht unterbrochen werden. Anschließend sollten Sie durch eine Agarosegelelektrophorese die Menge und die Qualität der isolierten DNA überprüfen (etwa 1 h).
Folgeexperimente:
Mit der DNA-Isolierung erschließen Sie sich die Grundlage für viele Experimente. Hier werden einige dargestellt.
Aufgaben
- Isolieren Sie mit einem Kit die chromosomale DNA aus E. coli, Bacillus subtilis oder einem anderen Prokaryoten.
- Überprüfen Sie anschließend in einer Agarosegelelektrophorese die Qualität der isolierten DNA.
- Durch kleine Änderungen können Sie mit diesem Verfahren DNA auch aus Bakteriophagen, Hefen, Pflanzen und tierischen Geweben isolieren.
Lernziele
Sie lernen eine einfache Methode für die Isolierung der chromosomalen DNA aus Bakterien kennen. Damit gelangen Sie an die Gene des Prokaryoten. Sie werden den Erfolg Ihrer DNA-Isolierung kontrollieren und eine Reihe wichtiger Folgeexperimente durchführen können.
Durch kleine Änderungen dieser Methode können Sie die chromosomale DNA auch aus Hefen, Tieren und Pflanzen isolieren.
Probleme
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Es ist im Agarosgel keine chromosomale DNA nachweisbar. | Sie haben vermutlich wenig DNA isoliert. Diese Menge sollte aber z.B. für eine PCR ausreichend sein. |
| Zusätzlich zur DNA-Bande befindet sich in der Front des Agarosegels ein "Schmier". | Vermutlich haben Sie noch RNA isoliert. Setzen Sie RNase zu oder inkubieren Sie den RNase-Verdau länger. |
| Die Bande der chromosomalen DNA ist in den niedermolekularen Bereich verschmiert. | Vermutlich haben Nukleasen die DNA fragmentiert. Arbeiten Sie zügig, steril und notfalls auf Eis. Vermeiden Sie häufige Scherkräfte auf die DNA. |
| Aus Bacillus habe ich keine chromosomale DNA erhalten. | Wenn Sie aus E. coli, nicht aber aus Bacillus chrmosomale DNA isolieren konnten. dann benötigt Ihr Bacillus-Stamm die besondere Prozedur zum Aufschluss Gram-positiver Zellen. |
Tipps und Hinweise
- Der Zellaufschluss ist bei den meisten Organismen der kritische Schritt der Methode. Manchmal hilft auch mehrfaches Frieren in flüssigem Stickstoff und Tauen bei 35°C in schnellen Zyklen, um die Zellen autolytisch aufzuschliesen.
- Pipettieren und mischen Sie vorsichtig. Scherkräfte fragmentieren die chromosomale DNA. Mischen Sie, in dem Sie die geschlossenen Eppendorfgefäße mehrfach über ihre Längsachse kippen.
- Beachten Sie bei Gram-positiven Bakterien (z.B. Bacillus subtilis), dass eventuell ein besonderes Verfahren zum Aufschluß der wesentlich dickeren Zellwand (Murein) angewendet werden muß, als es bei E. coli, einem Gram-negativen Bakterium, notwendig ist.
Fragen
- Wie lang ist das Genom des E. coli (4,2 x 106 bp) und das haploide Genom des Menschen (3 x 109 bp), wenn ein DNA-Stück von 10 Basenpaaren (diese Länge entspricht in etwa einer Periode der Doppelhelix) eine Länge von 3,5 nm hat?
- Wie viel fach muß diese E. coli-DNA in der Zelle aufgewickelt sein, damit sie in das Zellinnere des Baktreiums passt? (Zelllänge einer E. coli-Zelle: 1 µm)
- Wie viele Basenpaare müsste eine DNA-Polymerase in E. coli neu synthetisieren, wenn das Bakterium eine Verdopplungszeit von 30 min hat? Während der Verdopplung muß natürlich auch die chromosomale DNA verdoppelt werden.
- Mit welcher Umdrehungsgeschwindigkeit (Upm) würde sich eine solche DNA-Polymerase über das Genom fortbewegen?