Methode

Das Verfahren folgt diesen Schritten: DNA-Extraktion aus Mundschleimhautzellen, PCR mit verschiedenen Primern, Analyse der PCR-Produkte durch eine spezielle Gelelektrophorese.

DNA-Extraktion aus Mundschleimhautzellen

1. Streichen Sie mit einem sterilen Wattestäbchen mehrfach kräftig über die Mundschleimhaut.
2. Pressen Sie dann das feuchte Wattestäbchen in 500 µl 1xTAE Puffer in einem sterilen Eppendorfgefäß aus.
3. Diese Lösung wird abzentrifugiert (2 min, 13000 g, RT).
4. Der Überstand wird verworfen und die Zellen im Niederschlag werden in 100 µl Chelex (oder 1x TAE Puffer) aufgenommen.
5. Geben Sie 5 µl Proteinase K hinzu und inkubieren Sie die Ansätze für 30 min bei 56°C.
6. Mischen Sie hin und wieder die Lösung während dieser Zeit.
7. Anschließend wird die Lösung abzentrifugiert (1 min, 13000 g, RT) und dann für 10 min bei 95°C inkubiert. Mischen Sie in dieser Zeit immer wieder die Lösung.
8. Stellen Sie die Probe für 5 min auf Eis.
9. Zentrifugieren Sie den Ansatz ab (10 min, 13000 g, RT).
10. Pipettieren Sie vorsichtig 50 µl des Überstandes ab und geben Sie diese in ein beschriftetes, steriles Eppendorfreaktionsgefäß.
11. Verwenden Sie 2 µl Extrakt als DNA-template in der PCR-Reaktion. Der DNA-Extrakt kann auch bei -20°C gelagert werden.
    
    

PCR-Reaktion

1. Pipettieren Sie auf die Ready-to-go-beads:
   1. 1 µl Primer (10 pmol/µl)
   2. 2 µl Template-DNA
   3. 22 µl steriles Wasser
   4. Endvolumen: 25 µl
2. Mischen Sie den Ansatz. Achten Sie darauf, dass die gesamte Flüssigkeit unten im PCR-Gefäß vorliegt.
3. Starten Sie das PCR-Programm:
   1. 60 sec bei 94°C
   2. 60 sec bei 60°C
   3. 60 sec bei 72°C
   4. dieser Temperaturzyklus wird 38 mal wiederholt. Abschließend werden unvollständige Amplifikate in 20 min bei 72°C vervollständigt.

Analyse der PCR-Produkte

1. Legen Sie ein Elchrom Spreadex 600 Gel mit seiner Trägerfolie nach unten in einen speziellen Puffertank. (Alternativ können Sie ein 2,5%-iges Agarosegel verwenden)
2. Geben Sie 600 ml Elektrophoresepuffer in den Tank; das Gel ist dann etwa 3-4 mm mit Flüssigkeit überschichtet.
3. Tarieren Sie dieses System genau waagerecht aus!
4. Tragen Sie 5 µl M3-Marker (oder alternativ den 50 Bp-Marker von Fermentas) als Referenz in die äußeren Spuren eines Elchrom Spreadex Gels 600 auf.
5. Tragen Sie 10 µl PCR-Produkt gemischt mit Auftragepuffer in die Spuren auf. Notieren Sie sich die Reihenfolge der Proben!
6. Starten Sie die Elektrophorese durch Anlegen einer Spannung von xx V (entspricht 10 V/cm).
7. Stoppen Sie die Entwicklung der Elchromgele nach 80 min. Dabei steigt die Temperatur des Elektrophorese-Puffers von RT auf etwa 50°C.
8. Trennen Sie das Elchromgel mit einer dünnen Nylonschnur von seiner Trägerfolie. Legen Sie das Gel mit der Trägerfolie nach unten auf eine 1L-Glasflasche.
9. Inkubieren Sie diese Gele in Ethidiumbromid (1 µg/ml 1x TAE-Puffer) oder in einem empfindlicheren Fräbereagenz. Verwenden Sie keinen TBE-Puffer!