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Voraussetzungen

Sie benötigen die Ausstattung für die PCR und eine leistungsfähige Elektrophoreseapparatur. Außerdem sollten Sie Elchrom Fertiggele für die Analyse verwenden, da diese Gele eine deutlich bessere Auftrennung kleiner DNA-Moleküle zeigen, als Standard-Agarosegele.

Dieser Versuch ist von der Analytik her gesehen ein sehr anspruchsvolles Experiment. Sie sollten es nur durchführen, wenn Sie ausreichende Vorerfahrungen mit einer einfacheren PCR und der Agarosegelelektrophorese haben.
 

Zeitbedarf

Zur Isolierung der chromosomalen DNA benötigen Sie etwa 1 Stunde, für die PCR etwa 3,5-4 Stunden und für die Auftrennung der Amplifikate im Gel etwa 1,5-2 Stunden.

Aufgaben

  1. Isolieren Sie chromosomale DNA aus der Mundschleimhaut verschiedener Personen.
  2. Führen Sie auf jede dieser Proben eine PCR auf verschiedene Loci als Einzelanalyse und als "Multiplex-Analyse" aus.
  3. Trennen Sie diese PCR-Amplifikate auf einem geeigneten Trennmedium.
  4. Vergleichen Sie nach Anfärbung mit Ethidiumbromid das erhaltene Muster verschiedener Personen ("Fingerprint").

Lernziele

  1. Sie lernen das "Fingerprinting" kennen. Wie Gerichtsmediziner können Sie Individuen molekularbiologisch unterscheiden.
     
  2. Sie lernen eine molekularbiologische Methode zur Geschlechtsbestimmung bei Menschen.
     
  3. In einer vereinfachten Analyse bestimmen Sie eine begrenzte Anzahl von Merkmalen, so dass auch nur eine begrenzte Aussage möglich wird.

Probleme

 

Beobachtung Lösungsansatz
Im Elchrom Gel sind keine Banden nachweisbar. Tragen Sie zur Kontrolle die PCR-Produkte in einem 3%igen Agarosegel auf. Notfalls kann auch ein 0,8%iges Agarosegel verwendet werden.
Banden sind im Agarosegel, nicht aber im Elchrom Gel sichtbar. Wenn Sie das Gel lange genug in einer funktionsfähigen Ethidiumbromidlösung inkubiert haben, dann kann das Problem nur mit dem Elchrom Gel selbst zusammenhängen. Haben Sie z.B. den Puffertank oder eine ihrer Lösungen mit Borat kontaminiert? Borat hemmt bereits in Spuren die Anfärbbarkeit der DNA im Elchrom Gel. TBE-Puffer enthält Borat!
Banden sind auch nicht im Agarosegel sichtbar. Sind nach Färbung mit EtBr auch im Agarosegel keine Banden erkennbar, dann haben Sie kein PCR-Produkt erhalten. Entweder hatten Sie keine template-DNA oder die PCR war gehemmt. Ist z.B. Chelex in den PCR-Ansatz gelangt? Schauen Sie auch bei der Problembeschreibung des PCR-Versuches nach.
Die Banden im Elchrom Gel laufen ungleichmäßig. War der Puffertank horizontal ausgerichtet? Eine ungleichmäßig hohe Überschichtung des Gels mit Puffer führt zu unterschiedlichen Stromflüssen im Gel. Dadurch können "schiefe" Banden entstehen.
Banden im Elchromgel sind unscharf. Gel war zu lange unbeladen oder beladen ohne Spannung im Laufpuffer.
Das Elchrom Gel löst sich von seiner Trägerfolie. Möglicherweise ist das Gel zu alt. Achten Sie auf sein Haltbarkeitsdatum.
Es bilden sich Blasen im Elchrom Gel. Das Gel war vor Gebrauch gefroren bzw. nicht auf Raumtemperatur aufgewärmt.

Sicherheit

In diesem Experiment ist kein gesundheitsschädliches Potenzial erkennbar. Beachten Sie bei der Analyse der DNA-Amplifikate die Sicherheitshinweise beim Umgang mit dem Färbereagenz Ethidiumbromid und das Sicherheitsdatenblatt.

Tipps und Hinweise

  • Die Probanden sollten nicht kurz vor der Entnahme der Mundschleimhautzellen Kaffee, Tee, Coca Cola oder ähnliches getrunken haben. Sie sollten auch nicht geraucht haben. Solche Konsumgewohnheiten können die Bildung eines PCR-Produktes verhindern.
  • Verwenden Sie für die Isolierung chromosomaler DNA aus Mundschleimhautzellen Chelex, da dieser Ionenaustauscher PCR-Hemmstoffe binden kann. Die Ergebnisse werden sicherer.
  • Chelex sollte kurz vor Gebrauch als homogene Suspension vorliegen (Vortexer). Es darf unter keinen Umständen in die PCR-Ansätze gelangen; es würde die Taq-Polymerase hemmen.
  • Verwenden Sie nur frische Q-tips; diese müssen nicht autoklaviert werden. Vermeiden Sie es, die Wattebereiche anzufassen.
  • Zur Trennung der PCR-Amplifikate können alternativ 3%ige Agarosegele aus NuSieve 3:1 von Biozym verwendet werden. Die Trennung in diesen Agarosegelen ist eventuell nicht so klar wie auf Elchrom Fertiggelen, allerdings ist ihre Handhabung in einigen Verfahrensschritten einfacher.