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Enzym-Induktion

Methoden

Die Induktion der beta-Galaktosidase wird in folgenden Schritten gemessen:

  1. Züchten Sie auf dem Schüttelinkubator bei 37°C eine 5 ml E. coli DSM 613 Übernachtkultur in LB-Medium.
  2. Bereiten Sie 3 x 33 ml steriles LB-Medium in 300 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen vor. Nummerieren Sie diese Gefäße.
  3. Beimpfen Sie diese Medien mit jeweils 0,5 ml der Übernachtkultur.
  4. Messen Sie die O.D. der Kulturen bei 600 nm und inkubieren Sie diese auf einem Schüttelinkubator (37°C, 200 Upm), bis eine Optische Dichte von 0,8 - 1.0 erreicht ist.
  5. Entnehmen Sie aus jeder Kultur 2 ml Probe für den beta-Galaktosidase-Test. Verwenden Sie 2 ml Eppendorfreaktionsgefäße für diese Proben. Weitere Behandlung siehe unten.
  6. Entnehmen Sie nach 10 min und nach weiteren 5 min (insgesamt 15 min Versuchsablauf) jeweils noch einmal 2 ml Kultur für den beta-Galaktosidase-Test.
  7. Geben Sie dann in Kultur 1: 0,5 ml Lactose, in Kultur 2: 0,5 ml Lactose und 1 ml Glucose; in Kultur 3: 0,5 ml Lactose und 1 ml Chloramphenicol.
  8. Entnehmen Sie nach weiteren 10 min (insgesamt 25 min), und zu weiteren Zeitpunkten (siehe das Diagramm unter "Zeitbedarf" in den "Voraussetzungen") jeweils 2 ml Kultur.
  9. Nach insgesamt 60 min und 120 min Versuchsdauer messen Sie zusätzlich auch die Optische Dichte aus jeweils 0,5 ml zusätzlich entnommener Kultur.
  10. Zum letzten Messpunkt nach insgesamt 120 min Versuchsdauer entnehmen Sie zu den normalen 2 ml-Proben zusätzlich aus allen drei Kulturen weitere 2 ml, die Sie ebenfalls mit BugBuster aufschließen. Bevor diese zusätzlichen Aufschlüsse in den Enzymtest eingesetzt werden, zentrifugieren Sie sie aber ab (2 min, 13000 x g)!

Probenaufarbeitung für den beta-Galaktosidase-Test:

  1. 2 ml Kultur abzentrifugieren (2 min, 13000 x g)
  2. Überstand verwerfen und Niederschlag in 500 µl Enzympuffer resuspendieren.
  3. 100 µl BugBuster zugeben und 20 min bei RT inkubieren, gelegentlich schütteln.

Beta-Galaktosidase-Test:

    • 1,6 ml Enzympuffer
    • + 10 µl aus Schritt 3
    • + 200 µl 13,3 mM o-NPG
  1. Test 10 min bei 37°C im Heizblock inkubieren.
  2. Stoppen Sie die Reaktion, in dem Sie diese Ansätze in 1 ml 1M Na2CO3 pipettieren, das in 10 ml Reagenzgläsern vorgelegt ist.
  3. Messen Sie die Extinktion bei 420 nm und tragen Sie Ihre Messwerte in eine Tabelle ein.