Voraussetzungen
Sie benötigen einen Schüttelinkubator und ein Photometer zur Messung bei den Wellenlängen 420 und 600 nm. Erfahrungen mit dem Versuch "Messung der beta-Galaktosidase Aktivität" sind vorteilhaft.
Zeitbedarf: Für dieses Induktionsexperiment benötigen Sie etwa 3 Stunden Zeit. Davon dauert der eigentliche Versuch 2 Stunden.
Folgeexperimente: Sie können verschiedene Substrate, Induktoren und Inhibitoren der beta-Galaktosidase aus E. coli testen. Außerdem können Sie nach einem Zellaufschluss die cytoplasmatischen Proteine des Bakteriums im SDS-PAGE auftrennen und anschliessend einen "western blot" auf die beta-Galaktosidase durchführen.
Aufgaben
- Züchten Sie auf einem Schüttelinkubator drei E. coli Kulturen mit verschiedenen Kohlenstoffquellen. Verwenden Sie Lactose, eine Mischung aus Glucose und Lactose, sowie Lactose + Chlroamphenicol.
- Schließen Sie die Zellen mit BugBuster auf.
- Messen Sie photometrisch die beta-Galaktosidase-Aktivität.
- Zeigen Sie durch einen Enzymtest die Induktion der beta-Galaktosidase.
Lernziele
Am Beispiel der beta-Galaktosidase lernen Sie, die Biosynthese eines Enzyms anzuschalten. Sie lernen Parameter zu untersuchen, die einen Hinweis auf den zugrunde liegenden Regulationsmechanismus geben. Die Verstoffwechselung von Zuckern wird also von der molekularbiologischen Seite beleuchtet.
Zusatzinformationen
Daten zur beta-D-Galactosidase finden Sie in der Brenda-Datenbank (nach vorheriger Anmeldung) unter der EC Nummer 3.2.1.23.
Das Enzyme hydrolysiert o-glycosidische beta-D-Galaktoside. Als natürliches Substrat wird das Disaccharid Lactose (Milchzucker) gespalten, das aus D-Glucose und D-Galaktose aufgebaut ist.
Lactose + H2O ---> D-Glucose + D-Galaktose
Da das Enzym unspezifisch ist, werden auch andere O-Glycoside gespalten. So wird z.B. o-Nitrophenyl-beta-D-Galaktoside (o-NPG) in das gelbe o-Nitrophenol und die farblose D-Galaktose zerlegt. Diese Reaktion wird häufig zur Messung der beta-Galaktosidase-Aktivität verwendet.
Weitere Zusatzinformationen finden Sie im Versuch Messung der beta-Galaktosidase-Aktivität.
Probleme
Beachten Sie auch die Probleme und Lösungen beim Experiment "Aktivität der beta-Galaktosidase".
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Das Wachstum der Kulturen ist langsam. | Benutzen Sie wenige Medium im großen Erlenmeyer mit Schikanen, um eine große Oberfläche für die Sauerstoffnachdiffusion zu schaffen? Werden die Kulturen schnell genug geschüttelt (>200 Upm)? |
| Glucose hemmt nicht die beta-Galaktosidase-aktivität. | Haben Sie die richtige Konzentration der Glucose im Medium gewählt? |
Sicherheit
Sie arbeiten mit dem Antibiotikum Chloramphenicol. Chloramphenicol-haltige Lösungen sollten nicht in die Umwelt gelangen.
| Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien | |
| Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze | 100 KB |
| Chloramphenicol | 24 KB |
| Natriumcarbonat | 24 KB |
| BugBuster, Manual (136 K) | 32 KB |
| 2-Nitrophenol | 20 KB |
Tipps und Hinweise
- Sie sollten unbedingt das Experiment "Aktivität der beta-Galaktosidase" durchgeführt haben, bevor Sie diesen Versuch starten.
- Beachten Sie auch die Tipps und Hinweis beim Experiment "Aktivität der beta-Galaktosidase".
- Planen Sie ausreichend Zeit ein. Wenn Sie mit einer Übernachtkultur beginnen, dann müssen alle anderen benötigten Lösungen vorrätig sein und der Experimentablauf ist Ihnen klar geworden.
- Notfalls können Sie die Zellaufschlüsse sammeln und bei minus 20°C lagern, um sie später zu messen.
Fragen
- Warum wird die Biosynthese von Proteinen reguliert?
- Warum wird erst Glucose und dann Lactose verstoffwechselt?
- Wie könnte theoretische die Wachstumskurve einer E. coli-Kultur aussehen, die als Kohlenstoff- und Energiequelle Glucose und Lactose enthält? Erklären Sie Ihre Graphik!