Methode

1. Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher eine Bakterienkolonie von einer Agarplatte und überführen Sie die Zellen in ein Eppendorfreaktionsgefäß.
2. Alternativ: zentrifugieren Sie 50 µl einer Bakterien-Übernachtkultur in einem Eppendorfreaktionsgefäß ab (2 min bei einer 13 000-fachen Erdbeschleunigung g); verwerfen Sie den Überstand, der das Medium enthält. Führen Sie folgende Schritte durch.
3. Resuspendieren Sie die Bakterien-Zellen in 50 µl TE-Puffer und geben Sie 50 µl Aufschlusspuffer hinzu. Inkubieren Sie diesen Ansatz für 5 min bei 70°C. Die Zellklumpen lösen sich auf.
4. Kühlen Sie die Probe 5 min im Eisbad ab.
5. Pipettieren Sie in die Ansätze 1 µl 0,4%-ige Bromphenolblaulösung und 1 µl 4 M KCl.
6. Zentrifugieren Sie die Ansätze für 5 min bei 13 000g ab, um die Zelltrümmer zu entfernen. Sie arbeiten mit dem Überstand weiter, weil er die Plasmide enthält.
7. Mischen Sie 12 µl des Überstandes mit 2 µl 6x-Auftragepuffer.
8. Pipettieren Sie mit einer sterilen Pipettenspitze 10 µl Überstand in jeweils eine Probentasche Ihres Agarosegels. Vergessen Sie nicht einen DNA-Längenstandard in eine der freien Probentaschen aufzutragen.
9. Legen Sie maximal 7V pro cm Elektrodenabstand an, bei 15 cm Elektrodenabstand also maximal 120V. Wenn die Bromphenolblaubande das untere Ende des Agarosegels erreicht hat, schalten Sie die Spannungsquelle aus und trennen Sie die Elektroden von der Agarosegelkammer.
10. Entnehmen Sie das Agarosegel und färben Sie es mit Ethidiumbromid. Anschließend betrachten Sie das Agarosegel auf einem Transilluminator mit UV-Licht von 302 nm. Beachten Sie die Sicherheitshinweise für Ethidiumbromid und für den Umgang mit dem Transilluminator.