Diskussion

Die Bakterienzellen werden im cracking-Puffer aufgeschlossen. Die alkalischen Bedingungen (NaOH) und das Tensid SDS (sodium= Natriumdodecylsulfat) in diesem Puffer lösen die Zellmembranen in der Wärme auf. Dadurch werden die Plasmide freigesetzt. Nach dem Abzentrifugieren dieser Aufschlüsse befinden sich die Plasmide im Überstand. Der Zentrifugationsniederschlag besteht aus Zelltrümmern.

DNA liegt in den Zellen stark ineinander verdreht vor ("supercoiled"). Ihr Experiment liefert Ihnen für diese Aussage in diesem Versuch keinen direkten Nachweis. Das Plasmid pHAT wird aber mit 2800 Basenpaar Länge angegeben. Im Vergleich zu dieser Größe scheint das Plasmid ihrer Präparation wesentlich kleiner zu sein. Entweder enthielten ihre E. coli-Zellen kein pHAT-Plasmid, oder aber das Plasmid kommt hier tatsächlich in einer "supercoiled"-Form vor.

Um diese Frage zu klären, können Sie ein Experiment durchführen wie es unter Plasmidisolierung beschrieben wird. Sie vergleichen dazu die Wanderstrecke eines Plasmides aus "gecrackten" Zellen mit dem Plasmid einer Plasmidisolierung aus einer anderen Probe des gleichen Zellmaterials. Wenn Sie dann noch das Plasmid aus der Plasmidsiolierung mit einem Restriktionsenzym schneiden, so werden Sie tatsächlich feststellen, dass das Plasmid aus "gecrackten" Zellen weiter läuft, als das linearisierte, mit einer Restriktionsendonuklease geschnittene Plasmid aus der Plasmidisolierung. Alternativ könnte Sie auch das Plasmid aus ihrem jetzigen Agarosegel isolieren, mit einer Restriktionsendonuklease schneiden und diesen Verdau in einem neuen Agarosegel untersuchen.

Zu erklären ist diese Beobachtung durch das "kleiner" erscheinende "supercoiled"-Plasmid im Gegensatz zu dem größeren "linearisierten" Plasmid. Tatsächlich spielt also die Raumstruktur des Moleküls eine wichtige Rolle bei dieser Analysentechnik, weil die durch die Phosphatgruppen verursachte Ladung, die die Wanderung im elektrischen Feld bewirkt, in beiden Molekülstrukturen gleich groß ist!