Voraussetzungen

Sie benötigen eine Agarosegelkammer, Agarose und eine Spannungsquelle, sowie eine Möglichkeit zum Nachweis aufgetrennter DNA.

Zeitbedarf: Sie benötigen etwa 20 min für die Zelllyse, 20 min für das Vorbereiten des Agarosegels und 30 min bis 1 Stunde für die Agarosegelelektrophorese zu kalkulieren.

Folgeexperiment: Jedes Experiment, in dem eine Plasmidanalyse erforderlich ist.

Plasmidisolierung mit einem Reagenziensatz aus solchen Klonen, die nach dieser Reihenuntersuchung tatsächlich Plasmide enthalten. Reisolieren Sie das Plasmid aus dem Agarosegel, linearisieren Sie es durch eine Endonuklease und trennen Sie es erneut auf einem Agarosegel auf. Sie werden feststellen, dass die Raumstruktur des Plasmids einen Einfluss auf seine Wanderstrecke im Agarosegel hat.

Aufgaben

1. Züchten Sie plasmidhaltige und plasmidfreie E. coli Zellen auf LB-Agarplatten oder in Flüssigkulturen. Verwenden Sie zur Zellzucht das Antibiotikum, das durch das Antibiotikumresistenzgen des Plasmides vorgegeben ist. Zum Beispiel verwenden Sie Ampicillin bei pUC18, pBluescript, pHAT-GFPuv, pBR322 und bei pET. Bei pBR322 können Sie Ampicillin und/oder Tetracyclin einsetzen.
2. Schliessen Sie die Zellen auf und analysieren Sie mit der Agarosegelelektrophorese deren Plasmidgehalt.
3. Interpretieren Sie das Ergebnis Ihrer Analyse.

Lernziele

Sie lernen eine sehr schnelle und einfache Methode der Plasmidanalyse kennen. Diese Analysentechnik können Sie vielfältig einsetzten. Außerdem können Sie hier den direkten Beweis für das Vorkommen verschiedener Plasmidformen führen. Sie erkennen, dass die Längenangaben für Plasmid sich nur auf linearisierte Plasmid bezieht.

Probleme

Das Verfahren ist "narrensicher". Probleme sind keine bekannt.

Sicherheit

Sie verwenden einen Lysepuffer, der auch Ihre Hautzellen aufschliessen kann. Vermeiden Sie also den Hautkontakt. Waschen Sie sich sofort gründlich Ihre Hände, falls Sie mit dem Puffer in Berührung gekommen sind.

Zum Nachweis des Plasmides im Agarosegel verwenden Sie Ethidiumbromid. Beachten Sie die Sicherheitshinweise für den Umgang mit dieser Chemikalie.

Tipps und Hinweise

• Mischen Sie plasmidhaltige Lösungen mit anderen Lösungen sehr vorsichtig. Plasmide können durch Scherkräfte geschädigt werden, die Molekülstränge können aufbrechen.
• Verwenden Sie als DNA-Längenstandard eine fertige Mischung einer "1 kb Ladder" in Auftragepuffer mit Farbstoff.

Unterlagen

Die Zahlen geben die Dateigrößen in KB wieder. Zum Lesen der pdf-Dateien benötigen Sie den Adobe Acrobat Reader (einige Dateien wurden für Version 7 oder besser optimiert!). Zum Betrachten der ppt-Dateien benötigen Sie Microsofts PowerPoint. Deren Ausdruck als pdf-Datei erlaubt Ihnen die Herstellung von Folien für den Tageslichtprojektor.

Tipp: Laminieren Sie solche Seiten, die Sie häufiger als Arbeitsunterlagen nutzen möchten.

Fragen

1. In welchen Formen können Plasmide vorkommen?
2. Welchen Einfluss hat die Plasmid-Form auf die Analyse im Agarosegel?
3. Welche Zellstruktur kommt bei Zellen aller Lebewesen vor?
4. Wie erklären Sie die Auflösung der Zellmembran durch den "cracking"-Puffer?
5. Warum kann bei diesem Versuchsansatz kein Verdau mit einer Restriktionsendonuklease durchgeführt werden, bevor die Plasmide im Agarosegel aufgetrennt werden?
6. Was geschieht in diesem Verfahren mit der chromosomalen DNA und der RNA der Bakterienzellen?
7. Wie könnten sich Scherkräfte auf die räumliche Struktur der Plasmide auswirken?