Agarosegelelektrophorese

Abbildung 1: Agarosegel zur Trennung von DNA. Hier nach vollendeter Trennung.

Sie sehen im entwickelten Agarosegel nur die beiden Farbstoffe des Auftragepuffers. Die DNA ist als farbloses Molekül nicht zu erkennen. DNA-Banden werden erst nach der Färbung im Ethidiumbromidbad und anschließender Anregung der Fluoreszenz durch einen UV-Transilluminator sichtbar.

Abbildung 2: Agarosegelelektrophoretische Trennung von Reaktinsprodukten des Plasmides pUC18 mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen. Die Agarosegele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt. Fotographien nach Anregung durch einen UV-Transilluminator. Bild, von der linken zur rechten Spur: DNA-Längenstandard LS (Zahlen stehen für Anzahl der Basenpaare (Bp), pUC-Behandlungen mit verschiedenen Restriktionsendonukleasen.

Das mittlere Bild zeigt einige Unzulänglichkeiten einer Agarosegelelektrophorese, hier als Bandenverbreiterung und Verzug der Front zu erkennen. Im rechten Bild hat die Plasmidpräparation ein nur mangelhaft gereinigtes Produkt ergeben. Die Nasen deuten auf Membran- und/oder Zuckerreste hin.

Quantifizierung von Nukleinsäuren: Sie können Nukleinsäuren prinzipiell auf zwei Arten quantifizieren, indem Sie ein UV-Spektrum aufzeichnen oder eine Verdünnungsreihe im Agarosegel anlegen, bzw. gegen die Fluoreszenzintensität einer Bande mit bekannter DNA-Konzentration referenzieren.

Abbildung 3: Verdünnungsreihe eines Plasmides zur Quantifizierung der Plasmid-DNA.

Eine Abschätzung der Plasmidmenge kann nach folgendem Muster erfolgen. Nach einer Plasmidpräparation liegt die Plasmid-DNA in 50 µl Gesamtvolumen vor. Ein Teil dieser Plasmidpräparation wurde verdünnt. Von der unverdünnten Ausgangslösung und von den verdünnten Proben wurde jeweils 5 µl Probe auf das Agarosegel aufgetragen. Nach der Auftrennung und der Anfärbung mit Ethidiumbromid ist bei der Verdünnungsstufe von 1:20 die DNA-Bande gerade noch sichtbar. Sie enthält also etwa 10 ng DNA in 5 µl aufgetragener Probe. Damit enthält die unverdünnte Probe (10 ng x 20 =) 200 ng Plasmid-DNA/5 µl unverdünnter Probe. Es wurden also insgesamt 2000 ng = 2 µg Plasmid-DNA isoliert.