Voraussetzungen

Sie sollten überdies vertraut sein mit den grundlegenden Techniken des Autoklavierens, Kultivierens, ausplattierens und der Züchtung von Bakterien. Es wird vorausgesetzt, dass Sie z.B. durch Züchtung eine trübe Bakteriensuspension besitzen.

Zeitbedarf: Der Zeitbedarf für dieses Experiment ist abhängig von der Anzahl der Verdünnungsreihen. Sie werden etwa 1 Stunde Vorbereitungszeit zum Ansetzen der Agarplatten, der Verdünnungsreihe und zum Anlegen einer Übernachtkultur benötigen. Das eigentliche Experiment wird etwa 30 min dauern. Das Auszählen der Kolonien nach der Inkubation der Agarplatten hängt von der Anzahl der auswertbaren Agarplatten ab. Sie kann bis zu 5 min pro Agarplatte betragen.

Folgeexperimente: Diese Technik können Sie auf alle Bakterienkulturen anwenden, in denen die Zellzahl quantifiziert werden muß. Dies ist der Fall z.B. bei der Züchtung, beim "aeroben Wachstum" und bei Phagenexperimenten.

Aufgabe

1. Sie haben eine frische Übernachtkultur.
2. Messen Sie deren "Optische Dichte".
3. Setzen Sie aus der Übernachtkultur eine Verdünnungsreihe über 10 sequentielle 1:10-Verdünnungsschritte an.
4. Plattieren Sie diese Verdünnugsstufen auf Agarplatten aus.
5. Bebrühten Sie diese Agarplatten.
6. Zählen Sie die Kolonien auf den verschiedenene Agarplatten und berechnen Sie die Beziehung zwischen "Optischer Dichte" und Zellzahl.

Lernziele

Sie lernen in diesem Experiment einen eigenen Beweis für die hohen Bakterienzellzahlen pro Milliliter Kultur zu führen. Aus diesem Experiment können Sie eine Umrechnungsgröße berechnen, die Ihnen in zukünftigen Experimenten durch die wesentlich einfachere "Optische Dichtemessung" das mühsame und langwierige Ausplattieren und Auszählen von Kolonien erspart.

Zusatzinformationen

Wenn wir eine Verdünnungsreihe in 1:10-Verdünnugsschritten anlegen wollen, dann müssen wir nach den oben angegeben en Zellzahlen zehn Verdünnungsschritte für eine trübe Bakterienkultur einplanen. Wenn wir dann diese Verdünnungsreihe auf Agarplatten ausstreichen und sie bebrüten, dann werden wir auf einigen Agarplatten zwischen einer und einigen hundert Kolonien zählen können. Jede Kolonie ist aus einer lebensfähigen Zelle entstanden. Es handelt sich um einen Klon, genetisch identische Tochterzellen.

In den ersten Verdünnungsstufen werden noch sehr viele lebensfähige Zellen vorhanden sein, so dass auch sehr viele Kolonien gebildet werden. Diese Kolonien wachsen zum Teil ineinander; sie bilden einen "Rasen", der nicht auswertbar ist.

Eine andere Methode der Zellzahlbestimmung ist das Zählen von Zellen in der "Zählkammer" eines Mikroskopes. Mit dieser Technik wird die Gesamtkeimzahl bestimmt. Darunter versteht ein Mikrobiologe alle sichtbaren Zellen, unabhängig davon, ob sie lebend oder tot sind. Im Verfahren der Verdünnungsreihe werden aber nur die lebende, vermehrungsfähigen Keime bestimmt. Dies wird auch als KBE (Kolonie-bildende Einheit) oder im englische Sprachgebrauch als cfu (colony forming units) bezeichnet.

Beide Techniken haben den Nachteil, dass sie relativ aufwändig und zeitraubend sind. Daher wird in der Routine die schnellere "Optische Dichte"-Messung verwendet. Bei dieser Methode besteht in einem bestimmten Messbereich eine enge Korrelation zwischen Zellzahlen und der Trübung dieser Suspension, gemessen als "Optische Dichte". Mit diesem Versuch können Sie diese Korrelation bestimmen, in dem Sie die Optische Dichte mit der experimentell ermittelten Zellzahl korrelieren.

Probleme

Sicherheit

Es sind keine besonderen Sicherheitsmassnahmen zu beachten, wenn Sie mit plasmidfreien, definierten, nicht pathogenen Stämmen arbeiten. Der Drigalskispatel wird mit Alkohol abgeflammt. Achten Sie auf die leichte Entzündbarkeit des Alkohols.

Führen Sie mit Schülern zum erstenmal ein mikrobiologisches oder molekularbiologisches Experiment durch, so müssen die Schüler vor Versuchsbeginn unterwiesen werden.

Tipps und Hinweise

• Gerade in diesem Experiment verkürzen Sie wesentlich die Vorbereitungszeiten, wenn Sie es z.B. mit dem Züchtungs- oder Wachstumsexperiment kombinieren.
• Achten Sie strikt auf ordentliches Pipettieren, Mischen und Ausplattieren! Sie sehen später jeden Fehler auf den Agarplatten.
• Kalibieren Sie Ihre Pipette, in dem Sie mehrfach 1 ml Wasser auf eine Analysenwaage pipettieren und dieses Volumen auswiegen. Mehr dazu hier.
• Achten Sie darauf, dass ihre Kulturen nicht zu alt sind. In alten Kulturen kann ohne ein weiteres Experiment keine Voraussage zur Anzahl der lebensfähigen Keime gemacht werden.

• Sind viele Kolonien pro Agarplatte entstanden (siehe Abbildung 1), so können Sie durch Sektorierung in 4 oder 8 Felder die Zählflächen verkleinern. Zählen Sie dann mindestens zwei gegenüberliegende Sektoren aus und berechnen Sie daraus die Koloniezahl der gesamten Agarplattenfläche.
  
  
   

• Sie können die Lebensfähigkeit einer älteren Kultur mit der einer frischen Kultur vergleichen, oder den Einfluss von Bakterienhemmstoffen (z.B. Desinfektionsmittel, etc) untersuchen.
• Testen Sie den Unterschied in der Optischen Dichtemessung bei 578 nm und 600 nm an einer Probe. Mit Filterphotometer messen Sie bei 578 nm, mit Spektralphotometer hat sich die Wellenlänge von 600 nm eingebürgert.

Fragen

1. Welche Konsequenzen haben solch hohe Zelldichten für die Versorgung der Kultur mit Nährstoffen und Sauerstoff?
2. Mit welcher Frequenz erwarten Sie Mutationen in einer solchen Population? Welche Folgen ergeben sich für eine dichte Bakterienkultur daraus?
3. Warum sollte bei der Auswertung der Kolonien von KBE = koloniebildenden Einheiten gesprochen werden?
4. Was ist der Unterschied zwischen Gesamtkeimzahl und KBE?