Stammkultur
Methode
Anlegen | Schrägagarröhrchen | Reaktivierung | Öffnen einer DSMZ-Stammkultur
Die Stammkulturen werden nach folgenden Schritten angelegt:
Züchten Sie in 20 ml Reagenzgläsern Ihren E. coli Stamm in 5ml LB-Medium bis zu einer O.D.600 = 1-2.
Abbildung 1: Verdünnungsreihe zur Abschätzung der Optischen Dichte (O.D.600). Die letzte Verdünnung (O.D.600=0,15) zeigt nur noch eine geringe Trübung.
Daraus legen Sie eine tiefgefrorene Stammkultur und ein Schrägagarröhrchen an. Abschließend üben Sie die Reaktivierung. Für das Öffnen/Reaktivieren von DSMZ-Kulturen gibt es eine gesondert Anweisung (pdf, 120 KB).
Anlegen einer tiefgefrorenen Stammkultur
- Entnehmen Sie steril 2ml aus dieser Kultur und zentrifugieren Sie diese in einem sterilen Eppendorfreaktionsgefäß ab (1 min, 4000 Upm, RT). Sie können diesen Schritt auch ein-oder zweimal wiederholen, um eine höhere Bakteriendichte einzustellen.
- Verwerfen Sie den Überstand und geben Sie auf den Bakterienniederschlag 200µl 15%-iges steriles Glycerin.
- Resuspendieren Sie die Bakterienzellen im Glycerin.
- Portionieren Sie diese Suspension in 50 µl Volumina in sterile Eppendorfgefäße mit Schraubverschluss.
- Beschriften Sie das Gefäß.
- Frieren Sie diese Zellsuspensionen bei mindestens -20°C ein.
- Legen Sie eine Datenbank zu Ihren Isolaten an.
Anlegen eines Schrägagarröhrchens
- Bereiten Sie mehrere Schrägagarröhrchen für einen zu konservierenden Stamm vor.
- Erhitzen Sie LB-Agar (LB-Medium mit Zusatz von 1,5 g Agar pro 100 ml Medium), bis der Agar gelöst erscheint.
- Homogenisieren Sie diese Lösung und füllen Sie 7ml dieser Lösung in 20ml Reagenzglaser ab.
- Verschließen Sie diese Reagenzgläser mit Alu-Kappen.
- Autoklavieren Sie ihre Agar-Röhrchen (20 min, 121°C, 1bar Wasserdampfüberdruck).
- Entnehmen Sie die noch heißen Röhrchen aus dem Autoklaven und legen Sie diese Gefäße in schräger Lage auf eine Stativstange, die Sie mit Tesaband auf der Laborbank fixiert haben.
- Lassen Sie die Agarröhrchen erkalten.
- Streichen Sie auf dem erstarrten Agar mit der Impföse Ihren zu konservierenden Stammes in einer Zickzacklinie aus.
- Bebrüten Sie ihre Stammkultur für ein bis zwei Tage bei 37°C, bis Sie eine deutliche Spur aus Bakterienzellen entlang des Ausstriches erkennen können.
- Wickeln Sie um die Alukappe auf dem Reagenzglas einen Streifen Parafilm und stellen Sie diese bewachsenen Agarröhrchen in den Kühlschrank bei 4-8°C. Der Parafilm verhindert das Austrocknen der Agaroberfläche.
Reaktivierung einer tiefgefrorenen Stammkultur
- Desinfizieren Sie mit 70%-igem Ethanol die Aussenseite der Stammkulturgefäße, bevor Sie den Schraubdeckel öffnen.
- Verwenden Sie sterile Zahnstocher, die Sie mit einer abgeflammten Pinzette anfassen.
- Stechen Sie ein oder zweimal in die gefrorene Glycerin-Kultur. Notfalls tauen Sie die Glycerinkultur im Eisbad auf.
- Geben Sie den kontaminierten Zahnstocher in ein 20 ml Reagenzglas, das 5ml LB-Medium enthält.
- Inkubieren Sie diese Kultur samt Zahnstocher bei 37°C.
- Frieren Sie den Rest der Stammkultur sofort wieder ein, bevor sie aufgetaut ist.
Öffnen einer DSMZ-Stammkultur
Die offizielle Anweisung der DSMZ als pdf-Datei (120 KB).