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Voraussetzungen

Sie benötigen:

  • den zu konservierenden E. coli Stamm,
  • eine Tischzentrifuge
  • mehrere Schrägagarröhrchen sowie einen Bunsenbrenner und Impföse
  • und/oder: in einem Ständer sterile Eppendorfgefäße mit Schraubverschluss, steriles 15%-iges Glycerin, automatische 1ml-Pipette mit sterilen blauen Pipettenspitzen in einer Pipettenspitzenbox.
  • einen Kühlschrank und eine Tiefkühleinrichtung (mindestens -20°C)
  • und gute Kenntnisse der Kultivierungstechniken

 

Zeitbedarf: ca. 5-6 Stunden. Nehmen Sie sich ausreichend Zeit! Fehler bei Anlegen Ihrer Stammkulturen können den Erfolg Ihrer Experimente mit diesen Organismen in Frage stellen.

 

Folgeexperimente: alle Experimente, die eine Kultur erfordern.

Aufgabe

Ihre Aufgabe ist es, am Beispiel von E. coli eine eigene Stammkultur anzulegen.

  1. Sie züchten dazu eine frische Kultur und ernten Sie in der "logarithmischen" Wachstumsphase.
  2. Diese Zellen werden mit verschiedenen Techniken konserviert und möglichst tief gekühlt aufbewahrt.
  3. Zusätzlich sollten Sie eine Datenbank zu Ihrer Stammsammlung anlegen.

Lernziele

Sie lernen einen Vorrat an lebensfähigen Bakterien anzulegen. Aus diesem Vorrat können Sie jederzeit eine neue Kultur des Organismus ansetzen. Diese Technik ist ein sehr wichtiges mikrobiologisches Verfahren, ohne das die biotechnologische Industrie kaum über Jahre hinweg ihre rekombinanten Produkte in gleichbleibender Qualität herstellen könnte. Auch die Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) basiert auf dieser Technik.

Probleme

Beobachtung Lösung
Kultur wächst nicht an. Wurde die Probe zu häufig aufgetaut und eingefroren? Falsches Medium zur Anzucht verwendet? Verwenden Sie kleinere Portionen für die Stammkulturen (z.B. nur 200 µl), die rascher verbraucht werden. Auf Komplexmedien wie LB sollten vielen Ihrer Organismen wachsen können. Kontrollieren Sie den pH-Wert des Mediums.
Biochemische und physiologische Ergebnisse stimmen nicht mit der Ursprungskultur überein. Ist die Kultur verunreinigt durch andere Stämme? Gab es eine Verwechselung bei der Beschriftung der Kulturgefäße? Überprüfen Sie die Zutrittregelungen zur Stammkultur. Bei der Herstellung der Stammkultur sollten Sie immer nur mit einem Organismus arbeiten, um Verwechselungen auszuschließen. Streichen Sie die Kultur auf Agarplatten aus und bewerten Sie die Koloniemorphologie auf Einheitlichkeit. Wenn möglich, beurteilen Sie ein mikroskopisches Präparat.

Sicherheit

Es ist kein Gefahrenpotenzial erkennbar, wenn Sie mit nicht pathogenen Keimen arbeiten.

 

Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien
 
Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze 100 KB
Glycerin 24 KB

Tipps und Hinweis

  • Falls Sie einen Stamm von einer fachlich qualifizierten Quelle geliefert bekommen, so sollten Sie diesen Stamm sehr rasch nach der Lieferung in ihre Stammsammlung aufnehmen.
  • Zentrifugieren Sie die Zellen nicht bei maximaler Leistung und nicht zu lange ab, sonst wird der Zellniederschlag zu fest. Sie müssen dann die Zellen bei der Resuspension unnötig mechanisch "stressen".
  • Konzentrieren Sie Ihre Stammkultur um mindestens den Faktor 10. Dies erreichen Sie durch abzentrifugieren eines größeren Kulturvolumens und resuspendieren in einem kleineren Volumen Glycerins. Falls Bakterien während der Lagerung absterben, verbleiben so genügend lebensfähige Keime, um dennoch das schnelle Anwachsen einer Starterkultur zu ermöglichen.
  • Legen Sie Ihre Stammkulturen grundsätzlich in mehreren Proben und nur in kleinen bis kleinsten Portionen (etwa 200 µl) an. Beim späteren Zugriff auf diese Proben besteht die Gefahr der Kontamination. Daher sollte eine einzelne Sammlungsprobe nach wenigen Zugriffen vollständig verbraucht sein.
  • Verhindern Sie das Auftauen der Zellen, wenn Sie ein Inokulum aus der Stammkultur entnehmen. Wiederholtes Auftauen und Einfrieren lysiert die Zellen. Diese Lyse-Technik wird bei verschiedenen Versuchen gezielt eingesetzt, ist aber für lebensfähige Stammkulturen unerwünscht.
  • Bei Schrägagarröhrchen streichen Sie nicht über den gesamten unteren Bereich der Agaroberfläche aus. Wenn die Röhrchen längere Zeit im Kühlschrank stehen, bildet sich im unteren Teil häufig eine Wasserphase.
  • Kontrollieren Sie Ihre angewachsene Starterkultur im mikroskopischen Präparat auf ein einheitliches Erscheinungsbild. Solche Untersuchungen sollten Sie regelmäßig durchführen, insbesondere bei häufigen Transfers der Kultur und bei kritischen Experimenten, die ohne Antibiotikum durchgeführt werden.
  • Legen Sie unbedingt eine Datenbank zu Ihren Kulturen an! Begrenzen Sie den Personenkreis, der Zugang zu Ihrer Stammsammlung hat!
  • Die Beschriftungen auf den Kulturröhrchen der Stammsammlung sollte enthalten: Bakteriengattung (Escherichia), Art (coli), Stamm (DH5alpha), Datum des Einfrierens und Abkürzung des Experimenatornamens.

Fragen

  1. Warum legen Sie überhaupt eine Stammkultur an, warum kultivieren Sie ihre Bakterienkulturen nicht kontinuierlich weiter?
  2. Welchen Einfluss hat die Temperatur auf die chemische Zusammensetzung einer Zellmembran?
  3. Warum haben Sie im Kühlschrank einen Wasserverlust aus offenen Kulturgefäßen?
  4. Warum verwenden Sie Schrägagarröhrchen anstelle einer normalen Agarplatte für die Konservierung über einige Wochen?