Kultivierungstechniken

Methode

Ansetzen von Agarplatten | Ausplattieren | Ausstreichen | Überimpfen | Kolonie-picken (Masterplate) | Schrägagarröhrchen

Ansetzen von Agarplatten: Für etwa 5-8 Agarplatten wiegen Sie in einen 500 ml Erlenmeyer 2,5 g Standard I Medium (Merck, 1.07882.0500) und 1,5 g Agar Agar (Fluka, 05039) ab. Geben Sie 100 ml demineralisiertes Wasser hinzu. Vermischen Sie die Komponenten gründlich und verschließen Sie den Erlenmeyerkolben mit einer passenden Alu-Kappe. Autoklavieren Sie diesen Ansatz.

Bevor Sie die Agarplatten gießen, sollten Sie Ihre Laborfläche aufräumen und mit 80%-igen Ethanol besprühen Achten Sie darauf, dass Sie bei 60°C Ihren Agar aus dem Autoklaven entnehmen. Der Agar ist bei Temperaturen über 50°C noch flüssig. Sie können den Agar dann in 15-20 ml Portionen in die Petrischalen gießen und bei geschlossenem Decke auf der Laborbank erkalten lassen. Ihr 100 ml Ansatz sollte für etwa 5-8 Agarplatten ausreichen.

Sind die Agarplatten fest geworden, so beschriften Sie sie am Boden mit dem Hinweis auf das Medium. Dann können Sie diese Agarplatten in Stapeln aufschichten (maximal 10 Agarplatten pro Stapel) und sie über Nacht auf der Laborbank stehen lassen.

Ausplattieren

Diese Technik wird z.B. bei Verdünnungsreihen angewendet, mit dem Ziel, Einzelkolonien zu erhalten. Über Verdünnungsreihen lassen sich die Anzahl der Bakterien in einem bestimmten Kulturvolumen ermitteln.

Entnehmen Sie aus einer Bakterienkultur 50 µl oder 100 µl Suspension. Pipettieren Sie dieses Volumen auf die Mitte einer Agarplatte. Schießen Sie die Agarplatte.

Nehmen Sie den Drigalskispatel, tauchen Sie ihn kurz in sauberen, endosporenfreien 96%-igen Ethanol ein und flammen Sie ihn dann kurz in der Bunsenbrennerflamme ab.

Halten Sie den abgeflammten Drigalskispatel zunächst zum Erkalten auf einen keimfreien Teil der Agarplatte. Dann verteilen Sie die aufgetragen Flüssigkeitsmenge gleichmäßig auf der Agaroberfläche. Anfangs lässt sich der Drigalskispatel wegen des Flüssigkeitsfilms sehr leicht auf der Agraroberfläche bewegen ("Aquaplaning-Effekt"). Nach einigen Bewegungen ist die Flüssigkeit in den Agar "eingerieben". Dies ist der Zeitpunkt, zu dem der Widerstand bei der Bewegung des Drigalskispatels merklich zunimmt. Jetzt können Sie den Drigalskispatel wieder abnehmen, den Deckel der Agarplatte schließen, den Drigalskispatel erneut abflammen und im Ständer abstellen.

Ausstreichen

Diese Technik wird z.B. angewendet für das Anlegen von Stammkulturen. Solche Stammkulturen auf Agaroberflächen stehen über Tage, Wochen oder einige Monate für Experimente zur Verfügung. Im Verlauf des Ausstriches kommt es zur Vereinzelung von Bakterienzellen. Also können auch mit dieser Technik Klone erhalten werden.

Halten Sie eine oder mehrere Agarplatten, einen Bunsenbrenner und eine Platinimpföse in einem Ösenständer bereit. Ihr Arbeitsbereich ist mit 80%-igem Alkohol desinfiziert.

• Flammen Sie die Öse im Bunsenbrenner ab. Hinweise zum Verfahren gibt es hier.
• Lassen Sie die Öse im Ständer erkalten, der in der Nähe des Bunsenbrenners steht, oder führen Sie die Temperatur an einer nicht bewachsenen Fläche der Agarplatte ab.
• Nehmen Sie mit der erkalteten Öse einen Teil einer Kolonie oder Kulturflüssigkeit auf. Fassen Sie den Ösenhalter dazu an seinem hinteren Ende an.
• Öffnen Sie mit einer Hand den Deckel einer Agarplatte. Legen Sie ihn mit der Innenfläche nach unten auf eine desinifizierte Arbeitsfläche.
• Legen Sie die Öse mit ihrem Eigengewicht auf die Agaroberfläche und ziehen Sie sie ohne Druck auszuüben oder die Öse zu verkannten über die Agaroberfläche. Zwei Ausstricharten sind üblich:

• Verschliessen Sie die Agarplatte wieder mit ihrem Deckel.
• Flammen Sie wie unter (1.) beschrieben die Öse ab und stellen Sie sie in den Ständer zurück.
• Beschriften Sie mit einem Filzschreiber die Agarplatte an ihrem Boden, entweder am Seitenrand des Bodens oder entlang seiner Aussenseite. Der Text sollte enthalten: Datum, Stamm oder Experiment, Namenkürzel des Experimentators.
• Bebrüten Sie solche Agarplatten je nach Stamm oder experimenteller Anforderung in einem Brutschrank. Für viele Organismen sind Bedingungen zwischen Raumtemperatur und 37°C bei ein bis mehreren Tagen Inkubationszeit geeignet.

Überimpfen

Sie benötigen eine bewachsene Kultur und ein frisches, unbewachsenes Kulturröhrchen. Außerdem eine Impföse im Ösenständer und einen Bunsenbrenner.

1. Glühen Sie die Impföse in der Bunsenbrennerflamme aus.
2. Nehmen Sie das bewachsene und das unbewachsene Kulturröhrchen in die linke Hand (für "Rechtshändler").
3. Entfernen Sie beide Alu-Kappen von den Kulturgefäßen.
4. Ziehen Sie die geöffneten Kulturgefäße durch die Bunsenbrennerflamme. Achtung: Die Flamme sollte nur an den oberen Teil des Röhrchens schlagen. Sie führen diese Röhrchen mit der Vordre- und mit der Rückseite durch die Flamme!
5. Tauchen Sie die Impföse in das bewachsene Kulturröhrchen ein.
   1. Achtung: Die Ösenhalterung sollte nicht in die Kulturflüssigkeit eintauchen! Dies birgt die Gefahr einer Kontamination!
   2. Annahme: Ihre bewachsene Kultur hat 1 x 109 Bakterien pro ml Kultur und an der benetzten Impföse befinden sich 5 µl Kulturflüssigkeit, dann übertragen Sie 5 x 106 (5 Millionen!) Bakterien in das frische Kulturgefäß!
6. Tauchen Sie die Impföse in das unbewachsene Kulturröhrchen.
7. Flammen Sie die Kulturröhrchen wie oben beschrieben ab.
8. Setzen Sie die Alu-Kappen auf die Röhrchen.
9. Flammen Sie die Impföse aus und setzen Sie sie in den Ösenständer zurück.

Kolonie-picken mit Zahnstochern (anlegen einer Masterplate)

Sie benötigen eine Agarplatte mit (E. coli) Kolonien, sterile Zahnstocher (handelsübliche aus Holz) im passenden Plastikbecher, eine oder mehrere unbewachsene Agarplatten und eine Schablone, die unter die zu beimpfenden Agarplatten gelegt wird.

Schrägagarröhrchen

Das Schrägagarröhrchen ist eine Form der Stammkonservierung für Reinkulturen über mehrere Monate.

Material: Sie benötigen 20ml-Reagenzgläser mit passenden Alu-Kappen, gefüllt mit 5 ml Agarmedium, Reagenzglasständer aus Edelstahl, Parafilmstreifen.

Methode: Setzen Sie in einem 300 ml Plastikbecher 100 ml LB-Medium mit 1,5 g (=1,5%-igen) Agar-Agar an. Mischen Sie gut und verteilen Sie diese Lösung im 5 ml Portionen unter Rühren auf die 20ml-Reagenzgläser. Verschließen Sie diese Reagenzgläser mit Alu-Kappen und autoklavieren Sie sie. Der noch warme Agar wird in den Röhrchen auf eine etwa 1-2 cm hohe Kante (z.B. leeres Reagenzglas) gelegt und erstarren lassen. Anschließend kann auf der schrägen Agaroberfläche eine Reinkultur ausgestrichen werden. Nach dem Bebrüten werden diese Ansätze mit Parafilm verschlossen, um ein Austrocknen im Kühlschrank bei 4°C zu vermeiden.

Anmerkung: Die Röhrchen werden im Stehen gelagert. Streichen Sie nicht vom unteren Rand des Schrägagars aus, da sich bei der Lagerung im unteren Teil des Agars Flüssigkeit ansammeln kann.