Voraussetzungen

Sie sollten unbedingt einen definierten Kulturstamm verwenden, z.B. E. coli DSM 613. Außerdem sollten Sie die Grundausstattung für ein mikrobiologisches Labor besitzen und die Experimente zur Agarplattenherstellung und Medien, sowie die "Züchtung" kennen.

Zeitbedarf: Sie sollten für diese Übungen etwa 1-2 Stunden einplanen. Für die Vorbereitungen etwa noch einmal so viel.

Folgeexperimente: Wenn Sie diese Techniken beherrschen, können Sie alle NUGI-Experimente angehen, die mit einem Mikroorganismus durchgeführt werden. Sie sollten allerdings auch die anderen Grundtechniken (pipettieren, photometrieren, sterilfiltrieren, etc.) beherrschen, bevor Sie mit dem Anlegen einer Stammkultur, einer Verdünnungsreihe, oder mit dem Wachstumsexperiment, etc. fortfahren.

Aufgaben

1. Beschaffen Sie sich einen Bakterienstamm, von einer Stammsammlung wie der DSMZ oder von NUGI. Wir empfehlen Escherichia coli K12 (DSM 613) und/oder Bacillus subtilis (DSM 10T).
2. Bereiten Sie kleine Mengen an Kulturmedien vor: feste Medien in Form von "Agarplatten" und 5ml Flüssigkulturen in 20ml Reagenzgläsern.
3. Beimpfen Sie diese Medien und züchten Sie die Organismen.
4. Wiederholen Sie mehrfach die einzelnen Techniken, bis Sie die Handgriffe "im Schlaf beherrschen".
5. Informieren Sie sich auch beim "Züchtungsexperiment" und den anderen Grundtechniken (pipettieren, photometrieren, sterilfiltrieren, etc) bevor Sie beginnen.

Lernziele

Hier wird mit festen Medien das Ausplattieren, Ausstreichen und das Kolonie-picken von Bakterien vorgestellt. Ziel dieser Techniken ist es, auf Agarplatten einzeln liegende Kolonien zu erhalten. Mit dem "überimpfen" einer solchen Kolonie in Flüssigmedien vermehren Sie die Mikroorganismen in "Flüssigkulturen".

Sicherheit

1. Es sind keine besonderen Sicherheitsmassnahmen zu beachten, wenn Sie mit definierten, nicht pathogenen und plasmidfreien Keimen arbeiten.
2. Sie werden einen Bunsenbrenner und Ethanol benutzen. Achten Sie auf die Brandvorschriften! Stellen Sie sicher, dass alle notwendigen Massnahmen im Falle eines Brandes ergiffen werden können!
3. Achten Sie auf Pilzmycelien auf Ihren Agarplatten. Solche Agarplatten sollten nicht geöffnet werden, da die Luftmycelien Ihre Atmenluft mit Pilzsporen belasten. Autoklavieren Sie solchen Agarplatten.
4. Schauen Sie und Ihre Schüler vor Beginn der mikrobiologischen, molekularbiologischen Experimente die Sicherheitsunterweisung durch (als pdf-Datei oder als Powerpoint Präsentation). Lassen Sie sich diese Unterweisung durch Unterschrift bestätigen.

Tipps und Hinweise

1. Schneller lernen Sie, wenn Sie sich von einem Fachmann die Handgriffe zeigen lassen. Er wird Ihnen auch weitergehende Erklärungen geben können, warum etwas in der beschriebenen Weise durchgeführt wird. Behilflich sind NUGI und seine erfahrenen Fachlehrer.
2. Beschaffen Sie sich möglichst Flüssigmedien (Bouillon, Broth), die Sie bei Bedarf durch hinzufügen von Agar-Agar verfestigen können. Sie erhalten durch diese beiden getrennten Komponenten mehr experimentelle Flexibilität.
3. Beschaffen Sie sich für den Beginn einfache Komplexmedien, wie sie unter Material aufgeführt werden. Diese Medien erleichtern Ihnen das Arbeiten und verkürzen die Vorbereitungszeiten.
4. Beschaffen Sie sich gleich größere Mengen Medien (z.B. 500 g Packungen), wenn Sie gedenken über längere Zeit mehrere Versuche durchzuführen.
5. Haben Sie kein demineralisiertes Wasser, so können Sie auch mit Leitungswasser einen Versuch unternehmen. Haben Sie keine Alu-Kappen, so können Sie auch festere Alu-Folie zum Verschließen der Gefäße verwenden.
6. Haben Sie keinen Autoklaven, so kann auch ein Schnellkochtopf in Erwägung gezogen werden. Füllen Sie den Schnellkochtopf mit 800 ml Wasser und betreiben Sie ihn 45 min unter Kochbedingungen. Allerdings werden in diesem System keine 121°C erreicht. Auch die Gefährdung durch Siedeverzüge ist beträchtlich!
7. Desinfizieren Sie Ihren Arbeitsbereich mit 80%-igenm Alkohol, mit dem Sie diese Fläche besprühen. Achten Sie dabei auf Zündquellen (Bunsenbrenner, etc)!
8. Je länger Sie die geschlossenen Agarplatten auf der Laborbank stehen lassen, desto trockener wird deren Oberfläche. Trockenzeiten von 1-2 Tagen sind empfehlenswert für das Ausplattieren von Verdünnungsreihen.
9. Möchten Sie die fertigen Agarplatten erst in einigen Tagen benutzen, so sollten Sie diese Agarplatten in die mitgelieferte Plastiktüte der Petrischalen einpacken; verschließen Sie diese Plastiktüte und lagern Sie diese eingepackten Agarplatten im Kühlschrank bei 4-8°C.
10. Die Agaroberflächen müssen angetrocknet sein. Wären sie "feucht", d.h. auf ihrer Oberfläche befände sich ein flüssigkeitsfilm, so könnten die Bakterien sich über diesen Flüssigkeitsfilm auf der gesamten Agaroberfläche ausdehnen. Sie erhielten einen "Bakterienrasen" und keine "Einzelkolonien".
11. Wenn Sie mit endosporenbildenden Mikroorganismen wie Bacillus arbeiten, so können solche Endosporen im Alkohol überleben. Mit einen endosporenhaltigen Alkohol kontaminieren Sie bei einem Ausstrich Ihre Agarplatten. (Autoklavieren Sie solchen Alkohol nicht, sondern sterilfiltrieren Sie ihn mit einem geeigneten Sterilfilter)
12. Achten Sie beim Abflammen des Ethanols am Drigalskispatel unbedingt darauf, dass dieser Drigalskispatel nur für sehr kurz Zeit in die Bunsenbrennerflamme gehalten wird! Der Spatel würde sich anderfalls zu stark erhitzen. Dadurch könnten die kleinen Flüssigkeitsmengen, die Sie mit dem Drigalskispatel verteilen, rasch auf höhere Temperaturen aufgeheizt werden. Die Bakterien könnten dann hitzeinaktiviert werden.
13. Bevor Sie mit einem abgeflammten Drigalskispatel eine Bakteriensuspension ausstreichen, sollten Sie den noch warmen Spatel auf einem keimfreien Teil der Agarplatte erkalten lassen.
14. Brennt Ihr Alkohol nicht, so kann er verdünnt sein. Stellen Sie sicher, dass Sie mit einem Alkoholgehalt über 90% arbeiten.
15. Anstelle von Alu-Kappen können Sie auch Alu-Folie verwenden. Deren Nutzungsdauer und Festigkeit ist aber beschränkt.
16. Impfösen sollten aus dem teueren Platin sein, da sie wesentlich dauerhafter sind, als Ösen aus Eisen. Imfösen aus Eisen korridieren unter den oxidiernden und reduzierenden Flammenbedingungen sehr rasch.

Fragen

1. Warum sollten Agarplatten eingepackt sein, wenn sie im Kühlschrank gelagert werden?
2. Warum soll der mit Ethanol benetzte Drigalskispatel nur sehr kurz in die Flamme gehalten werden?
3. Warum ist eine Platinöse dauerhafter für Ausstriche geeignet als eine Öse aus Eisen?
4. Warum können die Schrägagarkulturen nicht zur Stammhaltung über Jahre eingesetzt werden?