Voraussetzungen
Sie benötigen eine trübe Bakterienkultur mit wachsenden Zellen, Agarplatten und einen mikrobiologischen Arbeitsplatz (Bunsenbrenner, Alkohol, Drigalskispatel). Sie sollten mit den Kultivierungstechniken vertraut sein.
Zeitbedarf: Für das eigentliche Experiment benötigen Sie 10-20 Minuten. Für die Vorbereitungen (Agarplattenherstellung und Autoklavieren) insgesamt 3 Stunden. Für die Bebrütung: einen Tag; für die Auswertung 5-10 Minuten.
Folgeexperimente: Alle Versuche, die temperaturempfindliche aber sterile Lösungen erfordern. Im Phagenversuch trennen Sie mit einem Sterilfilter die Phagen von Bakterien.
Aufgaben
Sterilfiltrieren Sie eine trübe Bakteriensuspension und geben Sie das Filtrat auf eine Agarplatte. Bringen Sie auf eine zweite Agarplatte nicht sterilfiltrierte Suspension aus. Bebrüten Sie beide Agarplatten und bestimmen Sie die KBE (Koloniebildenden Einheiten). Formulieren Sie das zu erwartende Ergebnis.
Lernziele
Sie überzeugen sich hier von der Wirksamkeit eines Sterilfilters. Er wird Ihnen helfen, sterile Lösungen schnell herzustellen. Experimente wie der Phagenversuch zeigen Ihnen aber, dass sich die Wirksamkeit eines Sterilfilters auf größere Partikel, nicht jedoch auf kleine Teilchen oder gar auf gelöste Substanzen wie Pyrogene (Zellwandbestandteile Gram-negativer Bakterien wie E. coli) beschränkt.
Zusatzinformationen
Sie haben eine Fermenterkultur, die mit Luft begast werden soll. Doch wie erhalte ich keimfreie Luft? Auch hier hilft Ihnen ein Sterilfilter.
Oder: Ein Biotechnologe hat in einer Fermenation ein kostbares rekombinantes Protein hergestellt. Er möchte es schnell konzentrieren und dabei von Medienbestandteilen abtrennen. Sie ahnen es schon: ein Filter hilft in dieser Situation.
Oder, oder,....... Es gibt viele unterschiedliche Anwendungen, bei denen Ihnen Filter sehr gute Dienste leisten können. Wir betrachten hier als Standardanwendungen die Sterilfiltration von Lösungen und von Gasen, durch die keimfreie Flüssigkeiten oder Gase erhalten werden sollen.
Bakterien haben in der Regel eine feste Zellwand, die ihnen ihre Form verleihen. Wegen dieser Form können die Partikel abfiltriert werden, wenn die Poren des Filters kleiner als die Partikelgröße ist.
Allerdings haben einige Bakterien keine Zellwand. Solche zellwandlosen Bakterien wie Mycoplasma sind formvariabel. Sie können sich daher durch die Poren "hindurchquetschen". Tatsächlich wurden in der Vergangenheit viele Mycoplasmen-Kontiminationen in sterilfiltrierten Medien von Zellkulturen gefunden. Es gibt Mycoplasmen-Testsystem, mit denen Zellkulturen auf "Mycoplasma-Freiheit" geprüft werden können.
Probleme
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Das "sterile" Permeat des Filters liefert Kolonien. | Handelt es sich um E. coli-Kolonien? Haben Sie den Drigalskispatel abgeflammt, bevor Sie die Probe ausplattiert haben? Wenn es sehr viele Kolonien ("Rasen") sind, dann könnte der Filter durchgebrochen sein. |
| Die Kolonien sehen anders aus als für E. coli zu erwarten ist. | Könnte es sich um Bacillus handeln? Haben Sie zuvor mit Endosporen gearbeitet und damit möglicherweise den Alkohol zum Abflammen verkeimt? |
| Der Filter ergab auch nach Abfiltrieren größerer Volumina trüber Suspensionen keinen nennenswerten Widerstand. | Kann der Filter defekt gewesen sein? |
| Das Filtrat erschien trübe. | Wahrscheinlich ist der Filter gerissen. Bakterien können ungehindert durch den "Filter" treten. Er kann nicht mehr für seine eigentliche Funktion genutzt werden. |
Sicherheit
Es besteht keine Gefahr für die Experimentatoren und die Umwelt, wenn Sie mit plasmidfreien, nicht pathogenen Bakterien arbeiten. Achten Sie aber auf die Handhabung des Ethanols in der Nähe der Bunsenbrennerflamme. Stellen Sie sicher, dass ein funktionsfähiger Feuerlöscher verfügbar ist.
| Tabelle 1: Sicherheitsdatenblätter als pdf-Dateien | |
| Abkürzungen, Gefahrensymbole, R+S-Sätze | 100 K |
| Ethanol | 28 K |
Tipps und Hinweise
- Nutzen Sie ein Vorexperiment wie die Züchtung oder die Kultivierungstechniken, um eine lebensfähige Bakteriensuspension zu haben. Das erspart Ihnen Vorbereitungszeit für dieses Experiment.
- Sie kontrollieren Ihre Technik, indem Sie zwei Proben auf Agarplatten ausplattieren. Mit der unfiltrierten Probe zeigen Sie die Lebensfähigkeit der Kultur, mit der filtrierten Probe die Funktionsweise des Filters.
- Beachten Sie, dass eine "trübe" Kultur etwa 107 Bakterien pro ml enthält. Mit 100 µl Probevolumen bringen Sie also eine Millionen Zellen auf die Agarplatten.
- Das "Totvolumen" vieler Filter beträgt etwa 1 ml, d.h., Sie müssen mehr als 1 ml Probe filtrieren, bis die Flüssigkeit (das Filtrat) aus dem Filter austritt.
- Achten Sie auf die Verfallsdaten, die auf den Sterilfilterpackungen aufgedruckt sind.
Verbote
- Fassen Sie niemals die Filterunterseite an, aus der das sterile Filtrat (Permeat) austritt.
- Filtrieren Sie niemals Lösungsmittel mit einem Filter, der nur für wässerige Lösungen vorgesehen ist.
Fragen
- Warum nutzen Mikrobiologen Filter mit einem Porendurchmesser von 0,2 µm?
- Können Sie mit einem Filter des Porendurchmessers von 0,2 µm alle Bakterien zurückhalten?