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Photometrieren

Methode

Photometrieren | Chlorophyll-Extraktion | Blaues Wunder | Protein-Bestimmung mit BCA

 

Photometrieren:

  1. Setzen Sie Stammlösungen Ihrer Probesubstanzen an. Beispiele finden Sie unter Material.
  2. Schalten Sie Ihr Photometer an und lassen Sie die Lampe einige Minuten warm werden. 
  3. Befüllen Sie die Küvette mit Ihrer Probelösung. Nutzen Sie nach Möglichkeit eine Pipette dazu. 
  4. Achten Sie auf die richtige Füllhöhe der Probelösung in Ihrer Küvette. Achten Sie auf reine Messflächen. 
  5. Schalten Sie den gewünschten Spektralbereich ein. 

Chlorophyll-Extraktion:

  1. Sammeln Sie einige grüne Blätter, alternativ Spinat oder anderes grünes Gemüse aus der Tiefkühltruhe.
  2. Zermörsern Sie die Blätter in Gegenwart von 1-2 ml 80%-igem Ethanol.
  3. Zentrifugieren Sie den Extrakt in der Tischzentrifuge: 5 min, 13000 x g.
  4. Trennen Sie den Überstand vom Niederschlag und photometrieren Sie diesen Überstand in einer UV-geeigneten Plastikküvette.
  5. Verdünnen Sie die Lösung mit 80%-igem Ethanol, falls die Extinktionen zu hoch sind: > 1. Optimaler Extinktionsbereich zwischen 0,1 und 1.
  6. Hinweis: Haben Sie die Chlorophylle aus phtotrophen Bakterien extrahiert, so sollten Sie Ihre photometrische Messung bis 900 nm oder gar über 1000 nm ausweiten.

Blaues Wunder:

  1. Geben Sie in ein 250 ml Schottglas 75 ml Wasser, 1 g festes NaOH, 4 g Glucose und 1 ml 0,2%-ige wässerige Methylenblaulösung. Rühren Sie diese Lösung mit einem Rührfisch auf einem Magnetrührer, oder verschliesen Sie das Glas und schütteln Sie es kräftig.
  2. Füllen Sie auch einen Teil der Lösung in eine Quarzglasküvette.

Proteinbestimmung mit BCA:

  1. Führen Sie eine Proteinbestimmung mit dem BCA-Reagenz durch.
  2. Füllen Sie den Reaktionsansatz vom Blindwert in eine saubere Quarzglasküvette, alternativ in eine UV-geeignete Plastikküvette und bestimmen Sie das Spektrum zwischen 340 und 600 nm.
  3. Füllen Sie dann den Ansatz mit einer mittleren Proteinmenge (z.B. 40 µg Protein) in die gleiche, vorher entleerte Küvette. Bestimmen Sie auch von dieser Lösung das Spektrum im Bereich zwischen 340 und 600 nm.
  4. Legen Sie beide Spektren aufeinander, um ihren Verlauf zu vergleichen.