Allgemeines

Voraussetzungen

Sie benötigen

• einen Autoklaven sowie das
• Material für die Kultivierung von E. coli Zellen: lebensfähige E. coli-Kultur, LB-Agarplatten, Drigalski-Spatel.

Zeitbedarf für dieses Experiment: etwa 2 Stunden. Davon etwa 20-30 Minuten für die Vorbereitung der Medien.

Folgeexperimente: Autoklavieren ist eine Voraussetzung für die meisten mikrobiologsichen oder molekularbiologischen Experiment. Gerade am Ende von molekularbiologischen Versuchen wird das Autoklavieren zur Inaktivierung von gentechnisch veränderten Organismen oder Denaturierung von Nukleinsäuren verwendet.

Aufgaben

1. Autoklavieren Sie eine flüssige Probe, die E. coli Zellen enthält.
2. Streichen Sie mit dem Drigalskispatel anschliessend verschiedene Volumenmengen der abgekühlten, autoklavierten Probe auf LB-Agarplatten aus.
3. Inkubieren Sie diese Agarplatten bei 37°C über Nacht.
4. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien, d.h. der lebensfähigen Zellen, die Sie mit ihrer behandelten Probe auf die Agarplatten ausgestrichen haben.
5. Vergleichen Sie diesen Ansatz mit einer nicht autoklavierten Probe ihrer E. coli Suspension.

Lernziele

Sie lernen einen sehr wichtigen Prozess zur Abtötung lebender Keime (Sterilisation) kennen. Durch dieses Verfahren werden Sie in die Lage versetzt, die Ausgangsbedingungen Ihre Experimente zu kontrollieren und die Entsorgung der Versuchsabfälle zu sichern.

Dieses Verfahren wird auch großtechnisch in vielen Industriebereichen angewendet.

Probleme

Es können ab und zu folgende Probleme auftreten.

Sicherheit

• Beachten Sie bitte auch die Verbote!
• Wenn Sie einen modernen Autoklaven verwenden, sind keine Sicherheitsrisiken bekannt. Es wird jedoch empfohlen, Schutzkleidung und Schutzbrille beim Be-und Entladen des Autoklaven zu tragen.
• Nutzen Sie einen Autoklaven-Ersatz, so ist die Gefährdung des Experimentators konstruktionsbedingt. In der Regel muss bei der Entnahme des Sterilgutes mit Siedeverzügen gerechnet werden.
• Prüfen Sie mindestens zweimal jährlich mit einer Sterikon Bioindikatorampulle die korrekte Funktion Ihres Autoklaven.
• Verwenden Sie routinemäßig Indikatorstreifen zur Temperaturkontrolle während des Autoklavierzyklus.

Tipps und Hinweise

Variationen: Sie können dieses Experiment variieren, in dem Sie zusätzlich eine versporte Bacillus subtilis Kultur verwenden. Bacillus subtilis ist ein Endosporenbildner, wegen denen die Autoklavierbedingungen entwickelt wurden. Testen Sie, ob Sie tatsächlich solche Endosporen abtöten.

Alternativ können Sie auch eine Sterikon Bioindikator-Ampulle verwenden. In solchen Test-Ampullen werden in der Regel Endosporen von Bacillus stearothermophilus verwendet, der besonders thermostabile Endosporen bildet. In diesem Fall müssen Sie aber die Ampulle, bzw. den Ausstrich daraus bei 60-65°C inkubieren.

• Beachten Sie die Ausdehnung von Materialien, Flüssigkeiten und Gasen bei Temperaturerhöhungen.
• Verschliessen Sie gefüllte oder ungefüllte Gefäße nicht.
• Bekleben Sie jedes Gefäß mit einem kleinen Streifen Indiaktorband. Nach dem Autoklavieren signalisiert Ihnen das verfärbte Band, dass dieses Gefäße autoklaviert worden ist.
• Vermeiden Sie Medien zweimal zu autoklavieren.
• Je größer die Menge des Sterilgutes (insbesondere auch der Flüssigkeitsmenge) ist, desto größer ist die Ausgleichszeit. Das ist die Zeit, in der die Temperatur im Autoklavennutzraum auf das Sterilgut übergeht.

Haben Sie einen Temperaturfühler-geregelten Autoklaven, so sollten Sie den Temperaturfühler in ein Gefäß mit Wasser stellen, dass im Autoklaveninnenraum mitinkubiert wird.

• Halten Sie die Sterilisierzeiten so kurz wie möglich. Je länger Sie autoklavieren, desto mehr unerwünschte Nebenprodukte werden im Medium gebildet.
• Achten Sie auf homogene Lösungen, bevor diese autoklaviert werden. Vermeiden Sie z.B. hochkonzentrierten Agar ohne vorheriges Aufkochen zu autoklavieren. Es könnten sich Phasen mit höherer Dicht bilden, die schlecht durchmischt und damit nicht autoklaviert werden.
• Achten Sie auf den pH-Wert organischer Medien. Der pH-Wert wird sich mit der Temperaturerhöhung ändern. Es kann zur Hydrolyse der organischen Verbindungen kommen.
• Inaktivieren Sie alle Ihre biologischen Abfälle und Flüssigkeitsabfälle, soweit sie Antibiotika enthalten. Anschließend können diese autoklaviert en Materialien im Hausmüll bzw. im Ausguss entsorgt werden.
• Autoklavieren Sie nach Möglichkeit niemals Ammoniumsalze, Phosphate, Eisen und Zucker zusammen (Millard Reaktion).
• Testen Sie die Funktionsweise Ihres Autoklaven bei jedem Autoklaviervorgang mit geeigneten Indikatorstreifen (z.B. 3M) und zweimal pro Jahr mit einer Endosporen-Testsuspension, z.B. mit Sterikon plus Bioindikator (Merck, 1.10274.0004). Dokumentieren Sie das Ergebnis Ihrer Prüfung! Bleibt der Farbton des Indikators unverändert, so erfüllt Ihr Autoklav die vorgeschriebenen Bedingungen. Ein Farbumschlag von violett zu gelb zeigt dagegen eine ungenügende Sterilisation an.

• Sie sollten nur in Ausnahmefällen einen haushaltsüblichen Schnellkochtopf an Stelle eines Autoklaven verwenden. Bei der Verwendung eines Schnellkochtopfes sind besondere Sicherheitsvorkehrungen zu beachten! Hauptnachteile dieses Verfahrens sind:
  • Sie erreichen nicht 121°C,
  • haben einen sehr kleinen Nutzraum und
  • Verletzungen durch Siedeverzüge sind nicht ausgeschlossen.

• Beschaffen Sie einen "professionellen" Autoklaven mit ausreichendem Volumen (> 70 l). Diese größere finanzielle Investition ist durch folgende Argumente begründet:
  • Sie können sicher sein, dass Ihre Medien und Ihr sonstiges Sterilgut keimfrei ist. Das schafft reproduzierbare Ausgangsbedingungen für Ihre Experimente.
  • Am Ende der Experimente können Sie alle kontaminierten Geräte, Medien und Einwegmaterialien autoklavieren. Auch viele Biochemikalien wie Antibiotika werden durch die Hitze zerstört. Eine Diskussion der potentiellen Umweltgefährdung durch Ihre Versuche ist damit vom Tisch.
  • Für molekularbiologische Experimente bekommen Sie Nuklease-und RNase-freie Geräte und Flüssigkeiten.
  • Moderne Autoklaven besitzen Sicherheitseinrichtungen wie eine Innentemperatur-gesteuerte Deckelverriegelung, die einen unsachgemäßen Umgang mit dem Autoklaviergut unterbinden. Damit ist auch für unerfahrene Experimenatoren die Gefährdung durch Siedeverzüge und Verbrühungen ausgeschlossen.
  • Kleine Sterilraum-Volumina bedeuten für Sie wesentlich längere Vorbereitungszeiten! Gegebenenfalls müssen Sie bei kleiner Autoklavierkapazität mehrere Autoklavierzyklen durchführen, um das gesamte Sterilgut für mehrere Arbeitsgruppen herzurichten.

Verbote

• Öffnen Sie niemals den Autoklaven (oder Ihren Autoklavenersatz), wenn die Temperatur im Sterilisationsraum >70°C ist.
• Autoklavieren Sie keine leicht brennbaren Lösungsmittel! Falls erforderlich sollte z.B. Ethanol über einen lösungsmittelstabilen Sterilfilter keimfrei gemacht werden.
• Verschließen Sie zum Autoklavieren niemals Gefäße, unabhängig ob sie mit Flüssigkeiten gefüllt sind oder nicht.
• Autoklavieren Sie niemals Gefäße, die zu mehr als die Hälfte ihres Volumens mit Flüssigkeit gefüllt sind.

Fragen

1. Nennen Sie technische Bereiche, in denen Materialien autoklaviert werden.
2. Nennen Sie technische Bereiche, in denen zwar sterile Produkte benötigt werden, diese Produkte aber nicht autoklaviert werden können.
3. Welche alternative Verfahren zum Autoklavieren kennen Sie?
4. Warum werden zum Autoklavieren 121°C verwendet?
5. Warum wird Wasserdampf verwendet?
6. Warum muß mit Wasserdampfüberdruck gearbeitet werden?