Allgemeines

Voraussetzungen

• Eine Minimalforderung für das Autoklavieren ist ein Schnellkochtopf, damit Sie definierte Ausgangsbedingungen für ihre Kulturen herstellen können. Ein Autoklav ist besser, da er mehr Sicherheit liefert.
• Besorgen Sie sich eine Stammkultur eines "Standard-Bakteriums". Für den Beginn empfehlen wir E. coli. Das Bakterium können Sie von der DSMZ oder von NUGI beziehen.
• Sie sollten dann sofort aus dieser Stammkultur eine eigene Stammkultur anlegen. Für deren Lagerung benötigen Sie mindestens minus 20°C (Kühlfach).
• Sie sollten für eine Flüssigkultur 20ml-Reagenzgläser oder zur Herstellung von Agarplatten Plastikpertischalen besitzen.
• Die Inkubation der Kulturen sollte auf einem Schüttler erfolgen. Sie kann notfalls aber auch bei Raumtemperatur ohne Schütteln durchgeführt werden.

Aufgaben

1. Stellen Sie aus LB-Pulver und Wasser ein flüssiges Nährmedium her.
2. Verteilen Sie einen Teil dieses Mediums in 5 ml Portionen auf Reagenzgläser.
3. Geben Sie in den anderen Teil diese Mediums Agar-Agar.
4. Gießen Sie aus dem agarhaltigen Medium Agarplatten.
5. Trocknen Sie diese Agarplatten für etwa einen Tag bei Raumtemperatur.
6. Lagern Sie die Medien bis zum Gebrauch im Kühlschrank bei 4°C. Die Agarplatten werden dazu in einem Plastikbeutel vor weiterer Austrocknung geschützt.

Lernziele

1. Sie lernen die praktische Herstellung eines Nährmediums.
2. Sie werden infomiert über die Medienbestandteile und deren Funktion.
3. Sie werden Agarplatten gießen, um Klone/Reinkulturen isolieren zu können. Dies ist eine wichtige Voraussetzung für gelungene Experimente.

Zusatzinformationen

Medien können nach verschiedenen Aspekten vorbereitet werden:

• zur Isolierung, Kulturerhaltung, oder für physiologisch-biochemische Untersuchungen, etc
• sie können aus komplexen Bestandteilen (Hefeexktrakt, Proteine,  Proteinhydrolysaten, etc) oder als Minimalmedien aus definierten chemischen Substanzen erstellt werden.

Komplexe Medien haben den Vorteil, dass sie schnell und einfach anzusetzen sind. Synthetische Medien erfordern ein aufwändiges Zusammenstellen verschiedenster Chemikalien. Unabhängig von der Art der Medien müssen jedoch alle Medien die Nährstoffansprüche der zu züchtenden Mikroorganismen erfüllen. Die chemische Zusammensetzung einer Zelle gibt daher prinzipiell auch ihre Nährstoffansprüche wieder, vorausgesetzt es handelt sich nicht um autotrophe Organismen. Außerdem ist es wichtig, neben der Kohlenstoffquelle auch eine Energiequelle bereit zu stellen. Häufig erfüllt diese Anforderung ein Zucker wie Glucose.

Zusammensetzung einer Zelle

Jede Zelle enthält  bis zu 80 oder 90 % Wasser, der Rest ist Trockenmasse. Diese Trockenmasse  besteht zu etwa 50 % aus Kohlenstoff, 14 % aus Stickstoff und 1-2 % aus Phosphat. Diese chemische Zusammensetzung der Trockenmasse gilt weitgehend für tierische, pflanzliche oder auch Bakterienzellen. Daneben gibt es noch "Spurenelemente", insbesondere Metalle wie Eisen, Kupfer, etc, die als katalytisch aktive Cofaktoren in Enzymen genutzt werden. Aus diesem Grund werden für die Züchtung von Zellen große Mengen Kohlenstoff benötigt, also Zucker oder Aminosäuren/Proteine. Gerade Aminosäuren liefern neben Kohlenstoff auch noch den Stickstoff. So verstehen wir leichter, dass in Medien große Mengen Zucker oder in komplexen Medien große Mengen Proteine bzw. Aminosäuren vorkommen. 

Maillard Reaktion

Von der Zubereitung unserer Nahrung wissen wir, dass es durch ihre Behandlung bei höheren Temperaturen offensichtlich zu chemischen Veränderungen kommt. Insbesondere die nicht enzymatische Bräunung spielt dabei eine Rolle, die so genannte Maillard Reaktion. Häufig reagieren Zucker mit Aminosäuren katalysiert durch Metalle zu farbigen Produkten, eine Reaktion, wie sie in komplexen Nährmedien ebenfalls vorkommen kann.

Medienzusätze

Manchmal werden Medienzusätze hinzugefügt, um das Wachstum einer unerwünschten Begleitflora zu unterdrücken (= Selektivmedien), oder um eine Identifizierung einer Organismenart durch eine direkte chemische Reaktion sichtbar zu machen (= Indikatormedien). durch 

Beispiel für ein Selektvimedium ist der EMB-Agar zur Anzucht von Enterobakaterien (Proteobakterien) wie das Gram-negative Darmbakterium Escherichia coli. Das Medium enthält geringe Konzentrationen von Eosin und Methylenblau. Beide Farbstoffe hemmen das Wachstum Gram-positiver Keime wie Bacillus subtilis bzw. erleichtern die Identifikation einer Bakterienart durch unterschiedlich Koloniefarben. 

Beispiele für ein Indikatormedium ist die so genannte MUG-Reaktion zum schnellen Nachweis von E. coli. Die Abkürzung MUG steht für 4-Methylumbelliferyl-beta-D-Glucopyranosid. Da E. coli eine entsprechende beta-Glykosidase besitzt, wird dieses farblose Glycosid in das fluoreszierende Methylumbelliferon und den farblosen Zucker gespalten. Da bereits geringe Konzentration Methylumeblliferon im langwelligen UV-Licht (ca. 360 nm) nachgewiesen werden können, kann E. coli schnell und empfindlich delektiert werden. Folglich spielt diese Reaktion z.B. in der mikrobiologischen Wasser/Trinkwasseranayltik eine wichtige Rolle für den Nachweis des Indikatorkeims E. coli, der auf fäkale Verunreinigungen der Wasserprobe hinweist. Auf diesem Prinzip basiert z.B. das kommerziell erhältliche Idexx-Verfahren Colilert.

Probleme

Sicherheit

• Sie gehen mit heißen Lösungen um. Schutzhandschuhe können die Arbeit erleichtern.
• Durch eine Deckelsicherung erlauben moderne Autoklaven den Zugriff auf die autoklavierten Lösungen erst, wenn diese auf < 80°C abgekühlt sind. Damit werden Siedeverzüge im autoklavierten Medium vermieden.
• Falls Sie als Autoklavenersatz einen Schnellkochtopf nutzen, so sollten Sie unbedingt auf eine längere Auskühlzeit achten.

Tipps und Hinweise

• Nutzen Sie für den Beginn ihrer Experimente so genannte Komplexmedien wie zum Beispiel das LB-Medium. Damit reduzieren Sie ihre Vorbereitungszeit und die Bakterien sollten auf jeden Fall wachsen.
• Kaufen Sie größere Mengen des Mediums. Da sie in der Regel mehrere Jahre haltbar sind, wird diese Lösung preiswerter für ihren Etat.
• Kaufen Sie Komplexmedien für Flüssigansätze und separat davon den Agar-Agar, damit sie daraus auch feste Medien herstellen können. Mit zwei getrennten Komponenten erhöhen Sie ihre Flexibilität.
• Bedenken Sie, der Agar muss im flüssigen Zustand (also bei 50-55°C) ausgegossen werden.
• Fertigmedien sind chick, aber teuer. Sie sind durchschnittlich 3-5 mal kostspieliger, als die oben skizzierte Lösung. Hinzu kommt: Fertigmedien haben eine begrenzte Verwendungsdauer von wenigen Wochen!
• Trocken Sie Agarplatten mindestens einen Tag auf der Laborbank bei Raumtemperatur.
• Agarplatten können anschließend für mehrere Tage/Wochen in einer Plastiktüte im Kühlschrank (6°C) gelagert werden.
• Autoklavierte Kulturröhrchen werden borvorzugt im Kühlschrank (6°C), notfalls aber auch lichtgeschützt bei Raumtemperatur für mehrere Tage/Wochen gelagert werden.
• Zum Abfüllen von Flüssigkulturen ist kein genaues Pipettieren erforderlich. Volumenabweigungen von 10% sind in der Regel tollerierbar. Sie können diesen Vorgang aber als Übung für exaktes Pipettiern nutzen.
• Wenn Sie häufiger solche Kulturen ansetzen werden, dann sei Ihnen ein Handdispenser empfohlen, mit dem Sie sehr schnell größere Anzahlen von Kulturen herrichten können.

Fragen

1. Warum können Agarplatten im Kühlschrank austrocknen, wenn Sie nicht in ein geschlossenes Behältnis verpackt werden?
2. Welche chemischen Bedingungen beim Herstellen der Medien könnten die Festigkeit der Agaroberflächen beeinträchtigen?
3. Welche chemischen Elemente müssen unbedingt in einem Medium zum Vermehren von Zellen vorhanden sein?
4. Welche dieser Elemente werden in höheren und welche in geringeren Konzentrationen benötigt?
5. Was sind die chemischen Bestandteile von Agar-Agar?