Protein-Bestimmung
Zusatzinformationen
Etwa 50% der Zelltrockenmasse aus den verschiedenen Organismen besteht aus Protein. Proteinmengen zu quantifizieren ist daher eine wichtige biochemische Aufgabe.
Im Prinzip werden mit den Proteinbestimmungsmethoden die Peptidbindungen quantifiziert. Unter einer Peptidbindung wird die Verknüpfung von Aminosäuren eines Proteins verstanden.
Abbildung 1: Peptidbindung von Aminosäuren in einem Protein.
Hier wird die BCA-Methode als Beispiel für einen empfindlichen Proteinnachweis und die Biuret-Methode als Beispiel für eine robuste Methode beschrieben. Bei der BCA-Methode wird dann ein Cu(I)-Ion durch zwei Moleküle BCA ("bicinchoninic acid") zu einem roten Farbkomplex gebunden. Dieser Komplex kann sehr empfindlich bei 562 nm gemessen werden. In der Biuret-Methode reagieren zwei Peptidbindungen mit Cu(II) zu einem blauen Komplex, der bei 450 nm gemessen wird.
Eine Zusammenfassung allgemein verfügbarer Proteinbestimmungsverfahren mit ihren Messbereichen und der Messwellenlänge liefert die nachfolgende Tabelle. Die UV-basierten Methoden sollten nur bei sehr wertvollen und in geringen Mengen verfügbaren gereinigten Proteinen verwendet werden. Die Messung bei 280 nm basiert auf dem Gehalt aromatischer Aminosäuren (Tyrosin, Phenylalanin) eines Proteins.
| Tabelle 1: Übersicht zu den Bestimmungsmethoden | |||
| UV-Bestimmungsmethoden | Messbereich | Messwellenlänge (nm) | |
| Absorption | 20 µg - 3 mg | bei 280 nm | |
| Absorption | 1 - 100 µg | bei 205 nm | |
| Farbreaktionen: | |||
| Lowry | 2 - 100 µg | 650 | |
| Biuret | 1- 10 mg | 450 | |
| Bradford | 1 - 20 µg | 590 | |
| BCA | 0,2 - 50 µg* | 562 | |
| (*) Hier ist eine BCA-Mirkomethode verglichen worden. | |||
BCA-Methode
Die BCA-Methode ist ein sehr empfindlicher Proteinnachweis. Peptidbindungen und die vier Aminosäuren Cystein, Cystin, Tryptophan und Tyrosin sollen für die Bestimmung bedeutsam sein. Die Bildung von Cu(I)-Ionen durch Proteine unter alkalischen Bedingungen entspricht dabei der Biuret Bestimmungsmethode. Ein Cu(I)-Ion wird dann durch zwei Moleküle BCA zu einem roten Farbkomplex gebunden. Dieser Komplex kann sehr empfindlich nachgewiesen werden.
Abbildung 2: Reaktionsmechanismus der BCA-Methode
Lowry-Methode
Unter alkalischen Bedingungen bilden zweiwertige Cu-Ionen einen Komplex mit einer Peptidbindung. Das Kupferion wird dabei zu einem einwertigen Ion reduziert. Monovalenten Cu-Ionen und die radikalischen Gruppen des Tyrosins, Tryptophans und des Cysteins reagieren mit dem Folin Reagenz, um ein instabiles Produkt zu bilden, das zu Molybden/Wolfram-Blau reduziert wird.