Voraussetzungen
Sie sollten ein Photometer und Pipetten besitzen sowie mit deren Handhabung vertraut sein. Das Photometer sollte je nach Methode im Wellenlängebereich von 450 bis 650 nm einstellbar sein.
Hier bieten wir Ihnen mehrere Bestimmungsmethoden an: Biuret, Lowry und BCA-Test.
Der Biuret-Test ist nicht besonders nachweisstark, d.h. Sie benötigen große Proteinmengen für die Proteinbestimmung. Für diesen Test gilt jedoch das allgemeine Prinzip: je unempfindlicher, desto störunanfälliger ist er auch.
Zeitbedarf: Der Zeitbedarf hängt von der
Folgeexperimente: Mit den Proteinbestimmungen können Sie die Mengen des Proteins in Ihrer SDS-PAGE messen. Sie können auch die "spezifische Aktivität" von Enzymen bestimmen, bei der die Enzymaktivität pro mg Protein angegeben bzw. berechnet wird. Außerdem können Sie quantiative Wachstumsversuche mit Bakterien (oder anderen Organismen) durchführen, in dem Sie die Proteinzunahme in den gebildeten Zellen bestimmen.
Aufgaben
- Setzen Sie eine Stammlösung mit Protein an (z.B. Rinderserumalbumin, BSA)
- Erstellen Sie eine Kalibriergerade für dieses Protein.
- Bestimmen Sie die Nachweisempfindlichkeit des Testsystems
- Bestimmen Sie den linearen Bereich Ihrer Messung
- Bestimmen Sie den Proteingehalt verschiedener Lebensmittel und Zellen.
Lernziele
Sie lernen in diesen Versuchen verschiedene Proteinbestimmungsmethoden kennen. Mit Biuret wählen Sie eine einfache, kostengünstige aber auch unempfindliche Nachweismethode. Der BCA-Test hingegen ist ein modernes Verfahren, das wegen seiner Schnelligkeit und Empfindlichkeit in Forschungslaboren eingesetzt wird.
Probleme
| Beobachtung | Lösungsansatz |
| Stark streuende Einzelwert bei Mehrfachbestimmungen. | Überprüfen Sie Ihre Pipettiertechnik. Prüfen Sie die Reproduzierbarkeit der Pipette, in dem Sie mehrfach definierte Volumina Wasser auf eine Waage pipettieren. Sind Ihre Reagenzgläser sauber, oder enthalten sie Proteine? |
| Die Kalibrierkurve verläuft im oberen Teil nicht mehr linear. | Haben Sie die angegebenen Proteinmengen und die Pipettiervolumina eingehalten? Haben Sie die Linearität Ihres Photometers überprüft? Messen Sie die Absorption nur innerhalb dieses linearen Bereiches? |
| In einer Lebensmittelprobe erhalte ich deutlich weniger/mehr Protein, als theoretisch zu erwarten ist. | Kennen Sie die Matrix ihrer Proteinprobe? Haben Sie Ihr Testsystem auf teststörende Matrixbestandteile untersucht z.B. Reduktionsmittel, etc? |
Tipps und Hinweise
- Wenn genügend Protein zur Verfügung steht, und wenn wenig Erfahrung mit solchen chemischen Bestimmungsmethoden vorliegt, sollten Sie mit der relativ unempfindlichen Biuret-Methode beginnen. Solche Methoden sind in der Regel auch wenig störanfällig.
- Fassen Sie die Meßküvetten niemals an den Messflächen an. Achten Sie auf den richtigen Sitz der Küvette in der Küvettenhalterung Ihres Photometers.
- Beachten Sie auch die Tipps und Hinweise unter "Photometer".
- Bestimmen Sie bei allen neuen Messreihen immer den Blindwert und einen Wert aus dem mittleren Bereich Ihrer Kalibrierkurve mit. Abweichungen von "normalen" Werten können einen Hinweis auf Veränderungen im Reagenz oder im Testansatz liefern.
- Pipettieren Sie genau! An der Streuung der Mehrfachwerte erkennen Sie die Genauigkeit Ihrer Pipettiertechnik.
- Die Streuung der Einzelwerte bei der BCA- und bei der Biuret-Methode sind kleiner als 3%. Beide Teste sind gut reproduzierbar. Aus diesem Grund sind Doppelbestimmungen ausreichend.
- Wenn Sie ein Spektralphotometer besitzen, mit dem Sie im langwelligen Bereich ein Spektrum aufzeichnen können, dann sollten Sie die vis-Spektren der Farbkomplexe aufzeichnen. Sie überzeugen sich damit, dass Sie bei den "richtigen" Wellenlängen arbeiten und damit das Maximum an Empfindlichkeit nutzen.
- Die BCA-Reaktion kann auch bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Dann verlängert sich aber die Inkubationsdauer auf 2 Stunden.