Diskussion

An ihren Extinktionsmesswerten können Sie eine deutliche Abhängigkeit der Reaktionsgeschwindigkeit von der Temperatur in der Messküvette feststellen. Bei 37°C ist die Glucose-Umsetzung nach etwa 5-6 Minuten komplett. Bei Raumtemperatur werden hingegen 15-20 Minuten benötigt. Messen Sie also nach 15 min und nach 20 min die Extinktionswerte, dann können Sie aus der Extinktionsdifferenz auf die Vollständigkeit der Reaktion schliessen.

Die Verdoppelung der Glucose-Konzentration führt zur Verdoppelung des gemessenen delta-Extinktionswertes. Auch dieser Befund ist selbstverständlich, solange die anderen Substrate wie z.B. NADP nicht limitierend sind.

 

Spezifität

Im Gegensatz zur beta-Galaktosidase ist diese Glucose-Messung spezifisch. Andere Zucker wie Galaktose, Lactose, Mannose, Saccharose und Fructose werden in der Gesamtreaktion nicht umgesetzt. Das schließt nicht aus, dass verschiedene Zucker durch die Hexokinase phosphoryliert werden. Das Beispiel der Fructose belegt diese These.

Die Versuche mit Fructose bei gleichzeitiger Zugabe der Phosphoglucoisomerase (PGI) zeigen, dass auch Fructose-6-Phosphat umgesetzt wird. Fructose-6-Phosphat wird durch die Hexokinase in der ersten Reaktion gebildet, wenn Fructose vorhanden ist. Damit beruht die Spezifität der Gesamtmessung einzig auf der 2. Reaktion, die durch die Glucose-6-Phosphat Dehydrogenase katalysiert wird.

Wenn Sie keine Magnesiumionen dem Testansatz zugeben, dann ist die Reaktion gehemmt. Daraus ist zu schließen, dass mindestens eine der beiden gekoppelten enzymatischen Reaktionen Magnesium-abhängig ist. Solche Mg2+-Abhängigkeiten sind von ATP-abhängigen Reaktionen bekannt. Folglich sollte in diesem Testansatz die Hexokinase Mg2+-abhängig sein. Diese Aussage wird durch die Daten zur Hexokinase (EC 2.7.1.1) in der Brenda-Datenbank bestätigt.

Diese Vermutung läßt sich überprüfen, in dem Sie die Fructose-Umsetzung testen. Ohne Mg2+ wird kein Fructose-6-Phosphat gebildet. Sie bekommen nach Zugabe von PGI und Glucose-6-Phophat Dehydrogenase keine weitere Umsetzung. Geben Sie aber dem Test Glucose-6-Phosphat bzw. Fructose-6-Phosphat hinzu, erhalten Sie eine NADPH-Bildung.