Beta-Lactamase

Abbildung 1: Farbumschlag des pH-Indikators Phenolrot als Reaktion auf die Umsetzung von Penicillin durch beta-Lactamase zur Penicillinsäure .

Dieser Farbumschlag kann im Spektralphotometer gemessen werden. Dabei wird erkennbar, warum die beta-Lactamase-Aktivität spektralphotometrisch bei 430 nm gemessen wird. Andererseits kann die Extinktion bei 560 nm herangezogen werden, um über ihre Abnahme die Bildung von Penicillinsäure ebenso zu messen.

Abbildung 2: Spektren des pH-Indiaktors Phenolrot im alkalischen pH-Bereich (oben) und im sauren pH-Bereich (unten).

Sie können diese spektrale Änderung auch durch eine Titration mit Essigsäure erzielen.

beta-Lactamase bei E. coli

Der E. coli Stamm DH5-alpha kann nicht auf ampicillinhaltigen Agarplatten wachsen. Seine beta-Lactamaseaktivität ist sehr gering. Wird jedoch ein Plasmid wie pUC18 in diesen Stamm transformiert, dann kann er sehr wohl auf diesen Agarplatten wachsen und seine beta-Lactamaseaktivität wird deutlich größer. Damit ist gezeigt, dass auf dem Plasmid ein Gen für die beta-Lactamase kodieren muss.

Abbildung 3: Wachstum von E. coli Stamm DH5alpha auf einer ampicillinhaltigen Agraplatte. A/Links: Stamm ohne Plasmid. B/Rechts: Stamm mit amp-Gen haltigem pUC18 Vector. Der rote Pfeil zeigt auf die gewachsenen E. coli Zellen.

Lokalisation

Durch abzentrifugieren der Zellen (3 min, 6 000 Upm, RT) wird ein Zellniederschlag und ein Zellüberstand erhalten. Wenn Sie den beta-Lactamase-Test mit beiden Fraktionen durchführen, so werden Sie die Enzymaktivität überwiegend in den Zellen nachweisen können. Daraus ist zu schließen, dass auch bei E. coli die beta-Lactamase ein zellgebundenes Enzym ist.

 

Charakterisierung

Wenn die beta-Lactamase-Aktivität ein Protein ist, dann sollte eine Hitzbehandlung der Zellen vor ihrer Inkubation im Testansatz zum Verlust dieser beta-Lactamase-Aktivität führen.

Abbildung 4: beta-Lactamase-Aktivität im Phenolrottest in Abhängigkeit von der Temperatur. Die Ansätze wurden jeweils mit 100 µl E. coli-Suspension beimpft und dann 50 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Kulturen waren wie folgt 15 min lang vorbehandelt; von links nach rechts: 50°C, 70°C, 80°C, 95°C, Raumtemperatur. Ganz rechts Kontrollansatz mit Wasser anstelle einer E. coli-Suspension. Obere Reihe kurz nach der Inkubation, untere Reihe nach 50-minütiger Inkubation bei 37°C.

Alle hitzebehandelten E. coli Zellen zeigen keinen Farbumschlag des Phenolrots. Nur bei den unbehandelten Zellen (untere Reihe, zweite Probe von rechts), ist der Umschlag nach gelb eindeutig sichtbar.