Voraussetzungen

Dieses Experiment kann in mehreren Versuchsvarianten mit unterschiedlichen Ansprüchen durchgeführt werden. Eine Basisversion ist die Inkubation von Bakterienzellen mit der Reagenzienlösung.

Falls Sie wissenschaftlicher vorgehen möchten, dann messen Sie die vis-Spektren und die Kinetiken dieser Farbreaktion. Dazu benötigen Sie ein Spektraphotometer.

Möchten Sie eine spezifischere Reaktion ausführen und mehr Parameter zur Enzymaktivität bestimmen, dann verwenden Sie den Nitrocefin-basierten Test. Dieser Ansatz ist kostspieliger.

Möchten Sie verschiedene Bakterienstämme auf beta-Lactamasen überprüfen, dann können Sie auch einen Nitrocefin-Testkit nutzen.

Sie können durch Erweiterungen des Versuches unterschiedliche Parameter wie den Einfluß des pH-Wertes oder einer komplexierenden Substanz auf die beta-Lacatamase testen.

Zeitbedarf

Herstellen des Reagenz: ca. 30 min

Test: je nach Anzahl der Proben und der gewählten Versuchsvariation bis zu 1 h.

Aufgaben

1. Optionaler Vorversuch: Säuern Sie 500 µl Reagenzienmischung mit Essigsäure an. Messen Sie dabei den jeweiligen pH-Wert mit einer pH-Elektrode und messen Sie die Farbänderungen im Photometer bei 430 und 560 nm.
2. Züchten Sie eine plasmid-haltige (pUC18) E. coli Kultur und eine weitere Kultur ohne Plasmid.
3. Zentrifugieren Sie die Zellen getrennt ab und inkubieren Sie das Zellmaterial in einer Reagenzienmischung.
4. Beobachten Sie den Farbumschlag der Reagenzienlösung.
   
    

Zusatzaufgaben:

1. Zeichnen Sie mit einem Spektralphotometer die geänderte Farbe der Lösungen auf.
2. Messen Sie die Reaktionszeiten bei verschiedenen Zellmengen.
3. Hitzebehandeln Sie die E. coli Zellen für 15 min bei 50 und bei 60 °C. Inkubieren Sie anschließend diese Zellen im beta-Lactamasetest.
4. Konzentrieren Sie das Medium (siehe oben Schritt 3) über ein Molekülfilter an und bestimmen Sie aus diesem Konzentrat die beta-Lactamase Aktivität.
5. Isolieren Sie das Plasmid pUC18 aus den E. coli Zellen und transformieren Sie damit den plasmidfreien E. coli Stamm. Testen Sie anschließend das Verhalten des transformierten Stammes gegen Ampicillin und auf seinen beta-Lactamase-Gehalt.
6. Testen Sie andere Bakterien auf beta-Lactamase-Aktivität: z.B. Bacillus subtilis, etc. Nutzen Sie dabei auch Nitrocefin-Teststreifen.

Lernziele

1. Sie lernen hier die Antibiotikaresistenz eines Bakteriums biochemisch nachzuweisen. Die Messung beruht auf einer beta-Lactamringspaltung, bei der eine Säure gebildet wird.
2. In einem einfachen Testansatz verfolgen Sie den Umschlag eines pH-Indikators, der Ihnen die Säurebildung anzeigt.
3. Mit einem Spektralphotometer können Sie die Farbänderung des pH-Indiaktors als Absoroptionsspektrum aufzeichnen und sich so von der Richtigkeit einiger Messparameter überzeugen.
4. In Kombination mit einem Transformationsexperiment können Sie sogar Hinweise auf das kodierende Gen der beta-Lactamase erhalten.

Probleme

Sicherheit

• Führen Sie diese Versuche nur durch, wenn Sie mikrobiologische Laborerfahrung haben und eine verantwortliche Person mit solchen Kenntnissen Sie beraten hat.
• Verwenden Sie nur die angegebenen, definierten Bakterienstämme. Natürlich ist es spannender, mit multiresistenten Keime aus einer antibiotika-belasteten Umgebung zu arbeiten. Dabei gingen Sie jedoch ein unkalkulierbares Gesundheitsrisiko ein!
• Die vorgeschlagenen Versuche mit E. coli sind unbedenklich.
• Informieren Sie sich vor einem Versuch von der Klassifizierung eines Bakteriums in die Sicherheitsgruppen. Eine zuverlässige zentrale Informationststelle für die Einordnung eines bestimmten Bakteriums in diese Gruppen ist die DSMZ. Für Schulen sind grundsätzlich nur S1-Organismen erlaubt.
• Halten Sie die untersuchten Kulturvolumina klein.
• Autoklavieren Sie alle Lösungen und Gefäße nach dem Experiment, die mit Keimen kontaminiert sein könnten. Beachten Sie die Regeln der Guten Laborpraxis.

Tipps und Hinweise

1. Verwenden Sie nur die erwähnten Bakterienstämme. Achten Sie unbedingt auf die Regeln der Guten Laborpraxis.
2. Verwenden Sie den Nitrocefin basierten Test, wenn Sie den Einfluß von pH-Werten oder von EDTA auf die beta-Lactamaseaktivität kontrollieren möchten.
3. Beachten Sie, dass das Reagenz bei Raumtemperatur nur einen Tag und bei minus 20 °C nur 14 Tage haltbar ist. Wenn schon vor der Zugabe von Zellen ein Gelb- oder Orangeton zu sehen ist, muss neues Reagenz angesetzt werden.
4. Achten Sie auf unspezifische Säurebildung oder auf puffernde Substanzen im Testansatz. Beide Einflüsse können das Ergebnis verfälschen.
5. Versuchen Sie eine Transformtion des pUC18-Vectors in E. coli Zellen und messen Sie den Effekt der erhöhten beta-Lactamase-Produktion. Dieses Experiment erfordert kein S1-Labor!

Fragen

1. Warum ist dieser Phenolrot-Test auf beta-Lactamasen nicht hoch spezifisch?
2. Nach welchem Prinzip könnten Hemmstoffe für beta-Lactamasen entwickelt werden?
3. Wie kann ein solcher Hemmmechanismus prinzipiell erklärt werden?
4. Wie könnte eine ideale Testsubstanz auf beta-Lactamasen aussehen?
5. Wo in den Zellen sollte die beta-Lactamase bei Gram-positiven und bei Gram-negativen Keimen lokalisiert sein?
6. Im Medium einer beta-Lactamase-haltigen E. coli-Kultur ist immer beta-Lactamase-Aktivität zu finden. Wie kann dieser Befund erklärt werden?
   
   A

Siehe auch weitere Fragen zum Thema Antibiotika: Resistenz, Nachweis.