Methode

Enzymmessung | Messung aus ganzen Zellen

Enzymmessung

Die Messung der beta-Galaktosidase-Aktivität mit drei Substraten (o-NPG, Glucose, X-Gal) verläuft nach folgenden Schritten:

• Beschriften Sie 5 kleine Reagenzgläser mit "0", "1" , "2" , "3" und "4". 
• Pipettieren Sie die folgenden Lösungen in diese Reagenzgläser:

	0	1	2	3	4
Puffer	700 µl	700 µl	700 µl	700 µl	700 µl
o-NPG	-	150 µl	150 µl	-	-
Glucose	-	-	150 µl	150 µl	-
X-Gal	-	-	-	-	150 µl
Wasser	300 µl	150 µl	-	150 µl	150 µl
Enzym	3 U	3 U	3 U	3 U	3 U

• Geben Sie in jedes Reagenzglas 2-4 U beta-Galaktosidase hinzu. Beispiele für die Berechnung der Enzymaktivität finden Sie unter Zusatzinformationen. 
• Inkubieren Sie die Ansätze bei 37°C für 20 Minuten. 
• Stoppen Sie die Reaktion durch 500 µl 1 M Na2CO3. 
• Transferieren Sie die Ansätze in eine reduzierte Plastikküvette und messen Sie die Absorption bei 420 nm bzw. bei 640 nm. 

Messung aus Zellen einer induzierten E. coli Kultur

Zellaufschluss:

1. Zentrifugieren Sie 2 ml einer Kultur in 2ml-Eppendorfreaktionsgefäßen ab (2 min, 13000 x g).
2. Verwerfen Sie den Überstand.
3. Nehmen Sie den Niederschlag in 500 µl Enzympuffer (100 mM Tris-HCl, pH 7,5) auf.
4. Geben Sie 100 µl BugBuster hinzu und inkubieren Sie 20 min bei Raumtemperatur. Schüttlen Sie den Ansatz gelegentlich. Hinweis: Schütteln Sie insbesondere den Ansatz 4 längere Zeit kräftig (Vortexer). Dadurch wird der Lösung Sauerstoff zugeführt, der die Indolbildung (blauer Farbstoff) begünstigt. 

Messung:

1. Geben Sie 1,6 ml Enzympuffer in ein Reagenzglas (oder 2ml-Eppendorfreaktionsgefäß).
2. Geben Sie 10 µl vom Zellaufschluss (Schritt 4) hinzu.
3. Geben Sie 200 µl 16 mM o-NPG (45 mg/10 ml Tris-HCl Puffer) hinzu.
4. Inkubieren Sie 10 min bei 37°C im Heizblock.
5. Stoppen Sie die Reaktion, in dem Sie sie in 1 ml 1 M Na2CO3 pipettieren, das in 10 ml Reagenzgläsern vorlegt ist.
6. Messen Sie die Extinktion bei 420 nm und tragen Sie Ihre Messwerte in eine Tabelle ein. (Bei positiver Reaktion färbt sich das Reagenz gelb.)