nugi

Transformation

Alternativmethode

  • LB-Medium, z.B. von Merck, 1.00547
  • Glucose (z.B. von Fluka 49160) und
  • 2x TSS bestehend aus LB-Medium pH 6,5 mit 20% (w/v) PEG 8000 (z.B. von Fluka 81272), 10% DMSO (z.B. von Fluka 41640) und 40-100 mM MgSO4.

Die Transformation verläuft nach folgenden Schritten:

  1. Herstellen kompetenter E. coli Zellen. 
  2. Züchten Sie eine 50 ml E.coli-Kultur in LB-Medium bis zu einer O.D.600 von 0,5-0,7. 
  3. Geben Sie 50 ml eisgekühltes 2xTSS-Medium hinzu. 
  4. Inkubieren Sie diesen Ansatz 15 Minuten auf Eis.
  5. Füllen Sie diesen Ansatz in 100 µl-Portionen in sterile Eppendorfreaktionsgefäße ab und verwenden Sie die Suspension sofort für eine Transformation, oder frieren Sie diese 100 µl-Kulturen bei -20°C ein. 
  6. Bereiten Sie 4 solcher Eppendorfgefäße und eines (Gefäß Nr. 1 mit 100 µl einer normalen, unbehandelten Kultur der O.D. 0,2-0,4) vor: in die Gefäße 1 , 2 und 3 geben Sie jeweils 1 µl Vectorlösung (0,1-10 ng Plasmid-DNA), in Gefäß 4 und 5 jeweils 1 µl steriles Wasser. 
  7. Kühlen Sie diese Ansätze 10-60 min in Eiswasser. 
  8. Geben Sie jeweils 900 µl LB-Medium hinzu, das 20 mM Glucose enthält. Inkubieren Sie diese Ansätze für 30-60 min bei 37°C. 
  9. Streichen Sie mit dem Drigalskispatel jeweils 100 µl aus den Ansätzen auf beschriftete Agarplatten aus : http://www.nugi-zentrum.de/Experimente/Molekularbiologie/Transformation/Methode_alternativ.html#
    1. LB, amp plus DNA (unbehandelte Kultur)
    2. LB, amp plus DNA (aus Gefäße 2 im Schritt 6)
    3. LB, ohne amp, plus DNA (aus Gefäß 3 im Schritt 6)
    4. LB, amp plus Wasser (aus Gefäß 4 im Schritt 6)
    5. LB, ohne amp plus Wasser (aus Gefäß 5 im Schritt 9)
  10. Inkubieren Sie diese Agarplatten bei 37°C über Nacht. 
  11. Auswertung:
    1. Zählen Sie die Kolonien auf den einzelnen Agarplatten.
    2. Berechnen Sie die Transformationseffizienz aus den auf amp-haltigen Agarplatten gewachsenen Kolonien (Ansatz 2, Schritt 9) dividiert durch die zugegebene Plasmidmenge. Diese Rechnung ergibt x Transformanden/µg Plasmid-DNA.
    3. Bestimmen Sie die Transformationsfrequenz. Bilden Sie dafür den Quotienten aus den Kolonien, die auf amp-haltigen Agarplatten und den Kolonien, die auf amp-freien Agarplatten gewachsen sind.
  12. Überprüfen Sie den Plasmidgehalt der Transformanden: entweder durch die schnelle cracking-Methode oder durch eine Plasmid-Isolierung.