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Isolierung chromosomaler DNA

Methode für Hefen

alternative Verfahren für Bakterien | Pflanzen | tierisches Gewebe | Phagen

 

Isolieren Sie chromosomale DNA aus Hefen nach folgenden Schritten:

  1. Zentrifugieren Sie bis zu 5 x 107 Hefe-Zellen in einem Eppendorfreaktionsgefäß: 5 min bei 5000 x g. 
  2. Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie den Zellniederschlag in 600 µl Sorbit-Puffer. 
  3. Geben Sie 200 U Lyticase hinzu. 
  4. Mischen Sie die Probe und inkubieren Sie den Ansatz 30 min bei 30°C. 
  5. Zentrifugieren Sie die entsandenen Sphäroplasten in 10 min bei 300 x g. 
  6. Nehmen Sie den Sphäroplasten-Niederschlag in 180 µl ATL-Puffer auf. 
  7. Geben Sie 20 µl Proteinase K zu und vortexen Sie. Inkubieren Sie bei 55°C für ca. 2 h bis die Zellen lysiert sind. Während der inkubation sollte in regelmäßigen Abständen kurz gevortext werden, damit die Proben durchmischt bleiben.
  8. Geben Sie 4 µl RNase A (100 mg/ml) hinzu. Mischen Sie und inkubieren Sie die Proben für 2 min bei Raumtemperatur.
  9. Geben Sie 200 µl AL-Puffer hinzu und mischen Sie die Lösung. 
  10. Inkubieren Sie die Probe 10 min bei 70°C. 
  11. Geben Sie 200 µl 96-100%-igen Ethanol hinzu. Mischen Sie die Lösung auf dem Vortexer. 
  12. Pipettieren Sie diese Mischung auf eine DNeasy-Säule, die in einem 2 ml Eppendorfgefäß steckt. 
  13. Zentrifugieren Sie 1 min bei 6000 x g. Verwerfen Sie den Durchlauf und das Eppendorfgefäß. 
  14. Stecken Sie das DNeasy-Säulchen in ein frisches 2 ml Eppendorfgefäß. Geben Sie 500 µl AW2-Puffer hinzu. 
  15. Zentrifugieren Sie 3 min bei voller Leistung in der Eppendorfzentrifuge. Verwerfen Sie den Durchlauf und das Eppendorfgefäß. 
  16. Geben Sie das DNeasy-Säulchen in ein frisches, steriles Eppendorfgefäß. Geben Sie 200 µl AE-Puffer auf die Membran des Säulchens und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 1 min. 
  17. Zentrifugieren Sie 1 min bei 6000 x g. 
  18. Geben Sie erneut 200 µl AE-Puffer auf die Membran. Inkubieren Sie erneut 1 min bei Raumtemperatur. Zentrifugieren Sie erneut 1 min bei 6000 x g. 
  19. Führen Sie eine Agarosegelelektrophorese durch, um Ihre Präparation der chromosomalen DNA zu überprüfen. Benutzen Sie dafür ein 0,8%-iges Agarosegel.