Glucose-Bestimmung
Alternative Glucose-Bestimmung
Allgemeines | Material | Methode | Ergebnisse | Sicherheit
Diese photometrische Glucose-Bestimmung erfolgt durch eine gekoppelte enzymatische Reaktion der Glucose-Oxidase (EC 1.1.3.4) und der Meerrettich-Peroxidase (EC 1.11.1.7). In der Reaktion wird der Redoxindikator ABTS (2,2´-Azino-di(3-ethyl-benzthiazoloin-6-sulfonsäure, Diammoniumsalz) aus seiner farblosen reduzierten Form in die grüngefärbte oxidierte Form überführt.
Glucose-Oxidase: beta-D-Glucose + H2O + O2 ----> D-Gluconsäure + H2O2
Peroxidase: H2O2 + 2 ABTSred -----> 2 H2O + 2 ABTSox (grün)
Die Reaktionsgleichgewichte liegen auf der rechten Seite.
Abbildung 1: Strukturformel des reduzierten (oben) und des zum stabilen, grüngefärbten Radikalkations oxidierten ABTS (unten).
Material
Glucose-Reagenz: Geben Sie folgende Substanzen in der angegebenen Reihenfolge zusammen:
- 17,6 g Na2HPO4 x 12 H2O
- 7,55 g NaH2PO4 x 2 H2O
- gelöst in 1 Liter demin. Wasser
- es sollte ein pH= 7 eingestellt sein (bitte kontrollieren Sie den pH-Wert).
- 0,5 g ABTS (oder 0,9 mM im Test)
- 3,35 mg GOD (entspricht 0,7 U/ml oder 2,1 U im Test)
- 6,65 mg POD (entspricht 0,7 U/ml oder 2,1 U im Test)
Halten Sie diese Lösung auf Eis. Sie muss jeden Tag frisch angesetzt werden.
0,5 mM Glucose-Stammlösung: 100 mg Glucose Monohydrat gelöst in einem Liter demin. Wasser.
Enzyme und Redoxindikator:
Methode
Pipettieren Sie in 10ml-Reagenzgläser
- 3 ml Glucose-Reagenz
- 0,2 ml Probe
- inkubieren Sie den Ansatz 30 min bei 37°C (Heizblock oder Wasserbad)
- messen Sie die Extinktion bei 405 nm (Filterphotometer) bzw. bei 415 nm im Spektralphotometer
Abbildung 2: UV-vis Spektren des ABTS.
Pipettierschema für die Kalibrierkurve:
| Tabelle 1: Pipettierschema für die Glucose-Kalibrierkurve | |||||
| Proben-Nr | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 |
| 0,5 mM Glucose-Stammlösung (µl) | - | 20 | 40 | 80 | 120 |
| demin. Wasser (µl) | 200 | 180 | 160 | 120 | 80 |
| Glucose Reagenz (ml) | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 |
Messen Sie die Kalibrierkurve in Doppelbestimmung. Die Probe 1 ist der Blindwert, da diese Probe keine Glucose enthält.
Schätzen Sie bei einer Glucose-Probelösung den möglichen Glucosegehalt ab und verdünnen Sie entsprechend die Probe, damit die zu erwartenden Messwerte im Bereich der Kalibrierkurve liegen.
Beachten Sie, dass die Messung eine Redoxreaktion ist. Wenn Sie eine Probe aus einer komplexen Matrix (z.B. Lebensmittel mit Ascorbinsäure etc.) messen, so können sich Störungen durch reduzierende oder oxidierende Bestandteile ergeben. Diese Störungen können über die Methode des "Internen Standards" bestimmt und herausgerechnet werden.
Ergebnisse
Folgende Messwert der Doppelbestimmungen könnten Sie mit der Kalibrierkurve erhalten:
| Tabelle 2: Messwerte zu einer Glucose-Kalibrierkurve | |||||
| Probe | E405 | E405 | delta-E405 | ||
| 1 | 0,144 | 0,144 | 0 | ||
| 2 | 0,185 | 0,189 | 0,043 | ||
| 3 | 0,225 | 0,230 | 0,084 | ||
| 4 | 0,315 | 0,310 | 0,169 | ||
| 5 | 0,410 | 0,415 | 0,269 | ||
Die delta-E405-Werte errechnen sich aus den Mittelwerten der Doppelbestimmungen nach Abzug des Blindwertes (Probe 1).